多肽P161聯(lián)合順鉑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用*

張夢(mèng)怡,鄭恒,陳鷹,陳建華

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430065;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430030;4.武漢凱泰新生物技術(shù)有限公司,武漢 430074)

多肽P161聯(lián)合順鉑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用*

張夢(mèng)怡1,2,鄭恒3,陳鷹1,陳建華4

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430065;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430030;4.武漢凱泰新生物技術(shù)有限公司,武漢 430074)

目的 體外檢測(cè)多肽P161聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。方法采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度DDP、P161單用及聯(lián)合用藥對(duì)人肝癌HepG2、人結(jié)腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782的生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果DDP和P161對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有劑量依賴性的抗增殖作用。聯(lián)合給藥組表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng),與DDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在相同的抑癌效果下可降低DDP的使用量。且在相同濃度梯度下,聯(lián)合用藥組對(duì)Panc-1的抑制效果較差,而對(duì)MA-782效果最好。結(jié)論P(yáng)161可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性,二者聯(lián)合用藥可降低DDP有效治療濃度。

順鉑;多肽;抗腫瘤

20世紀(jì)80年代,人們發(fā)現(xiàn)一些肽能增加化療藥物的敏感性并且低毒,在維持相同化學(xué)治療(化療)療效的同時(shí)能夠減少化療藥物的劑量,繼而降低毒副作用。G3BP是一種RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域段特異性結(jié)合蛋白,且在多種腫瘤組織和細(xì)胞中過量表達(dá)[1]。據(jù)此,本課題組合成得到一系列RasGAP SH3域段小多肽,分別研究它們的抗腫瘤活性,從中篩選到一個(gè)具有很強(qiáng)抑癌活性的多肽RasP161,定名為P161。前期研究證明,多肽P161能夠增強(qiáng)鉑類化療藥物抗結(jié)腸癌HCT116的活性[2-3]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)P161的抗腫瘤活性,筆者選取人肝癌HepG2、人結(jié)腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782為研究對(duì)象,采用四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法初步檢測(cè)P161聯(lián)合順鉑對(duì)上述5種癌細(xì)胞增殖的影響,為擴(kuò)大其基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)器材 RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,批號(hào):NYA0785);0.25%胰蛋白酶、MTT試劑(Sigma公司,進(jìn)口分裝);順鉑(cisplatin, DDP,德州德藥制藥有限公司,批號(hào):121102);二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amerisco公司,批號(hào):120213);胎牛血清(杭州四季青公司,批號(hào):120112); ELx800多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);人肝癌HepG2、人結(jié)腸癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782來源于武漢大學(xué)典型細(xì)胞庫(kù)。

1.2 P161的合成 多肽P161純度＞95%,相對(duì)分子質(zhì)量為3 636.32。由武漢凱泰新生物技術(shù)有限公司利用氨基酸殘基,運(yùn)用芴甲氧羰基方法合成,高效液相色譜(HPLC)法純化及分光儀檢測(cè),并保存于-20℃條件[4]。

1.3 受試藥物的配制 多肽P161用去離子水配制成10 mmol·L-1的母液,篩孔內(nèi)徑0.22 μm的一次性濾頭濾過后,置于-20℃下長(zhǎng)期保存。

1.4 細(xì)胞抑制率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、HT29、IE8、Panc-1及MA-782細(xì)胞,進(jìn)行消化離心,制成濃度為2.0×104個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL。設(shè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(加入等體積的RPMI1640完全培養(yǎng)液)、DDP組、P161組及聯(lián)合給藥組(DDP+P161),每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,放入5%二氧化碳(CO2)、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁24 h后,各實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的干預(yù)藥物。使得DDP組的終濃度為5,10,20, 40,80 μmol·L-1;P161組終濃度為5,10,20,40, 80 μmol·L-1;聯(lián)合用藥組終濃度為5+20、10+20、20+ 20、40+20、80+20 μmol·L-1,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)板棄孔內(nèi)液體,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液,加DMSO 150 μL振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值,并用空白對(duì)照組調(diào)零。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作5次,取其平均值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(IR),IR(%)= (1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多個(gè)樣本之間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

DDP單用組,高濃度抑制率大于低濃度,呈明顯的劑量依賴關(guān)系,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單用P161,除Panc-1細(xì)胞外,均有較好抑制效果,抑制率隨其濃度增加而增加,呈明顯的劑量依賴關(guān)系,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)IE8、HT29和MA-782細(xì)胞,單用P161在濃度＞40 μmol·L-1時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率高于單用DDP組。聯(lián)合給藥組抑制率隨DDP濃度增加而增加。在DDP濃度一定的條件下,對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率高于單用DDP組(P＜0.05)。除HT29細(xì)胞外,聯(lián)合給藥組在DDP用量為20 μmol·L-1時(shí),對(duì)腫瘤的抑制效果就可達(dá)到單用DDP 80 μmol·L-1時(shí)腫瘤抑制效果。在相同濃度梯度下,聯(lián)合用藥組對(duì)Panc-1的抑制率明顯低于其余4種細(xì)胞組(P＜0.01),而對(duì)MA-782抑制率最高。見表1。

3 討論

針對(duì)癌癥的治療,臨床主要采取手術(shù)切除、放射治療(放療)、化學(xué)治療(化療)以及靶向治療的方式。其中,化療在癌癥的治療中占重要地位。理想的化療是對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性的殺傷,而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性,由于癌細(xì)胞與人正常組織細(xì)胞間缺乏根本性的代謝差異,使大部分化療藥物的選擇性較差,毒副作用明顯,治療效果不盡如人意,非特異性化療藥物順鉑就是其中之一。前期證實(shí)G3BP與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性相關(guān),是一種腫瘤標(biāo)志物[5],因此筆者首次模擬并證實(shí)了G3BP的三維立體結(jié)構(gòu)?；谠摰鞍着c其結(jié)合蛋白R(shí)asGAP的相互作用模式,運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)原理設(shè)計(jì)獲得了一系列具特異性抗腫瘤活性的多肽,并結(jié)合多肽合成、細(xì)胞生物檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)合成并篩選出最具活性的抗腫瘤肽段。多肽P161就是以上述事實(shí)為基礎(chǔ)合理設(shè)計(jì)篩選出來的。初期,王軍等[6]對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)RasGAP SH3域段小多肽聯(lián)合順鉑與單用順鉑對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明其對(duì)人正常對(duì)照組織細(xì)胞毒副作用較小。

本研究結(jié)果顯示,在設(shè)定藥物濃度下,單用DDP和P161對(duì)腫瘤細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用,且隨藥物濃度的增加,兩種藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果也越明顯,均呈明顯的劑量依賴關(guān)系,但二者對(duì)不同癌細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合給藥組對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于相同濃度下的DDP組,說明P161很有可能是一種潛在的化療藥物增敏劑。值得注意的是聯(lián)合給藥組在保證抗腫瘤活性不變的前提下,減少鉑類用藥劑量,導(dǎo)致化療毒性的減弱,因此有可能整體改善化療的效果。此外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥組對(duì)Panc-1的抑制作用最差,較其他4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)MA-782的抑制作用最好。除實(shí)驗(yàn)誤差外,可能與G3BP在乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸腺癌等腫瘤組織和細(xì)胞中過量表達(dá)有關(guān)[7-8]。

表1 不同濃度DDP和P161單用或聯(lián)合使用對(duì)5類腫瘤細(xì)胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

表1 不同濃度DDP和P161單用或聯(lián)合使用對(duì)5類腫瘤細(xì)胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

與DDP組同一濃度比較,*1P＜0.05;與其他腫瘤細(xì)胞比較,*2P＜0.01Compared with DDP at the same concentration,*1P＜0.05;compared with other tumor cell lines,*2P＜0.01

Panc-1MA-782 DDP組56.23±1.438.96±1.258.35±1.579.44±0.5519組別藥物濃度/ (μmol·L-1)IE8HT29HepG2.67±1.65 108.95±1.6214.46±2.1012.81±1.5913.75±1.0028.87±0.40 2018.55±2.6026.68±0.9716.55±0.9616.72±1.1037.70±1.82 4021.04±2.4433.89±2.7735.18±8.0919.95±0.7849.07±0.69 8031.88±2.0943.92±1.4344.55±0.8824.77±0.7851.39±0.77 P161組53.97±1.153.80±1.057.19±1.723.74±0.8123.70±0.67 107.17±1.068.16±1.1114.53±1.378.89±1.5526.91±0.45 2017.15±1.7116.28±1.3617.32±1.3311.91±0.7136.13±0.93 4024.00±2.1836.57±1.1019.27±0.8314.63±0.6951.06±1.32 8039.91±2.3450.08±2.2232.32±8.8916.19±1.3063.67±4.08 DDP+P161組5+2023.24±2.03*117.90±2.35*117.73±1.36*113.99±1.13*1*239.49±1.15*110+2031.47±2.59*121.71±1.12*127.21±1.30*117.40±1.15*1*241.90±0.63*120+2038.53±2.17*128.88±0.89*141.51±1.21*124.22±1.66*1*259.45±0.39*140+2053.16±1.33*141.49±1.37*148.13±0.99*125.48±1.05*1*278.35±0.46*180+2075.99±2.19*159.23±0.56*151.61±2.30*128.01±0.62*1*286.54±1.23*1

綜上所述,相比于P161和DDP單用,兩藥聯(lián)合能提高腫瘤抑制率,但其與順鉑聯(lián)用時(shí)引起細(xì)胞凋亡、發(fā)揮協(xié)同作用的具體作用機(jī)制尚不清楚,有待在整體動(dòng)物的抗腫瘤藥效和機(jī)制中進(jìn)行進(jìn)一步的確證。

[1] 張夢(mèng)怡,陳鷹,陳建華,等.多肽P161聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌MA-782細(xì)胞株增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)藥師,2013, 16(12):1768-1771.

[2] ZHANG H,ZHANG S H,HE H,et al.P161 targets and downregulates G3BP to suppress cell growth and potentiate cisplaitin-mediated cytotoxicity to colon carcinoma HCT116 cells[J].Cancer Sci,2012,103(10):1848-1856.

[3] 張浩.以G3BP為潛在靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2012:84-86.

[4] 陳建華,黃毅,熊駿宇,等.治療或預(yù)防癌癥的多肽或衍生產(chǎn)品及其應(yīng)用:中國(guó),200910163852.1[P].2009-08-11.

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.008

Inhibitory Effect of Polypeptide P161 Combined with Cisplatin on Proliferation of Multiple Cancer Cells

ZHANG Meng-yi1,2,ZHENG Heng3,CHEN Ying1,CHEN Jian-hua4
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China;2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;3.Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;4.Wuhan Katy Gen Pharmaceuticals, Inc.,Wuhan 430074,China)

ObjectiveIn vitrodetection of anti-proliferative effects of P161 combined with cisplatin(DDP)on multiple cancer cells.MethodsGrowth inhibition rates of HepG2,HT29,IE8,Panc-1 and MA-782 treated by different concentrations of DDP,P161 and P161 combined with DDP were determined by MTT assay.ResultsDDP and P161 dosedependently inhibited proliferation of multiple tumor cells.A synergistic effect was found in DDP combined with P161 and there was a significant difference in the effect between DDP combined with P161 and DDP alone(P＜0.05).DDP dose could be decreased to reach the same inhibitory effect.In the same concentration gradient of DDP combined with P161,the inhibition rate of Panc-1 was low and that of MA-782 was high.ConclusionP161 can increase the sensitivity of tumor cells to DDP.The combination of P161 and DDP can reduce the effective therapeutic concentration of DDP.

Cisplatin;Polypeptide;Anticancer

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)10-1288-03

2013-07-30

2014-03-23

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011CDB541)

張夢(mèng)怡(1989-),女,湖北武漢人,藥師,在讀碩士,研究方向:腫瘤藥理學(xué)。電話:(0)13207146089,E-mail:zmy422335@hotmail.com。

陳鷹(1971-),女,湖北武漢人,副主任藥師,碩士生導(dǎo)師,博士,研究方向:生物藥劑學(xué)。電話:027-87649309, E-mail:cy9262005@yahoo.com.cn。

陳建華(1965-),男,教授,博士,研究方向:生物化學(xué)與制藥。電話:027-87690083,E-mail:jeff5ch@163.com。