丹參膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

程月發(fā),藍(lán)建芳,任新平,張珺,謝躍生

(1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院,唐山 063300;2.海南賽立克藥業(yè)有限公司,?？?571124)

丹參膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

程月發(fā)1,藍(lán)建芳2,任新平2,張珺1,謝躍生1

(1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院,唐山 063300;2.海南賽立克藥業(yè)有限公司,?？?571124)

目的 建立丹參膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》丹參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),分別采用熒光反應(yīng)、薄層色譜(TLC)鑒別法對(duì)丹參膠囊內(nèi)容物進(jìn)行丹參酮ⅡA定性鑒別;采用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛5種主要成分的含量測(cè)定。結(jié)果丹參酮ⅡA的TLC鑒別分離度好,專屬性強(qiáng)。HPLC檢測(cè)的濃度范圍:丹參酮ⅡA在2.046～40.92μg·mL-1、隱丹參酮在1.482 25～59.29μg·mL-1、丹酚酸B在1.502 55～60.102μg·mL-1、丹參素在11.49～459.582μg·mL-1、原兒茶醛在0.617 4～24.696μg·mL-1分別具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r均為0.999 9,平均加樣回收率分別為99.66%(RSD=0.91%),99.26%(RSD=0.88%), 99.09%(RSD=0.76%),100.51%(RSD=0.62%)和100.62%(RSD=0.82%)。3批號(hào)丹參膠囊中,除原兒茶醛檢出量較低外,其余4種成分均有一定的含量。結(jié)論建立的鑒別、檢查與含量測(cè)定方法,簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于丹參膠囊的質(zhì)量控制。

丹參膠囊;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);活性成分;色譜法,高效液相;色譜法,薄層

丹參膠囊是單味丹參藥材通過(guò)醇提和水提工藝制得的膠囊制劑,功能為活血化瘀,主要用于治療冠心病、心絞痛等疾病。經(jīng)醇提的成分主要為丹參酮ⅡA和隱丹參酮等二萜醌類化合物,經(jīng)水提的成分主要為丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛等酚酸類化合物。為保證丹參膠囊產(chǎn)品有效成分的穩(wěn)定性和可靠性,建立簡(jiǎn)便易行的鑒別、測(cè)定方法和控制標(biāo)準(zhǔn),筆者對(duì)丹參膠囊進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀、可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器和Agilent Chemstation色譜工作站(均為美國(guó)Agilent公司);BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius);SK5200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司,頻率53 kHz,功率200 W)。

1.2 藥品與試藥 丹參膠囊(批號(hào):110401,110701, 110901,供鑒別及檢查實(shí)驗(yàn),120901,120902,120903,供含量測(cè)定實(shí)驗(yàn),規(guī)格:每粒0.28 g)由海南賽立克藥業(yè)有限公司提供,空白對(duì)照膠囊制備除丹參提取物外,按處方量稱取輔料,混勻即得。甲醇、乙腈為色譜純;重蒸水(自制);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 對(duì)照品 丹參對(duì)照藥材(批號(hào):120923-200509)、丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào):110766-200619)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào):111562-201212),均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;隱丹參酮(批號(hào):GZDD-0096-201112)、丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào):0071-201102)、原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào):GZDD-0806-201201)均購(gòu)自貴州迪大生物有限公司,純度≥98%(實(shí)驗(yàn)中計(jì)算按純度98%執(zhí)行)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 熒光反應(yīng) 取本品1粒的內(nèi)容物,研細(xì),加乙醇5 m L,充分?jǐn)嚢?濾過(guò),取濾液數(shù)滴,滴在濾紙上,干燥后,置紫外光燈(365 nm)下觀察,顯藍(lán)色熒光;將濾紙條置氨蒸氣中熏20 min,取出,置紫外光燈(365 nm)下觀察,顯淡亮藍(lán)綠色熒光。另取空白膠囊內(nèi)容物,按供試品的熒光鑒別實(shí)驗(yàn)進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)3批次的供試品進(jìn)行檢查,3批供試品均呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光反應(yīng);空白膠囊均未呈現(xiàn)熒光反應(yīng)。

2.1.2 薄層色譜 取3批膠囊各10粒的內(nèi)容物,研細(xì),混勻,加乙醚20 mL,置具塞試管中,放置1 h,濾過(guò),濾液揮干,殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解,作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。取丹參酮ⅡA對(duì)照品,加乙酸乙酯制成濃度2 mg·mL-1,作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯(6∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的暗紅色斑點(diǎn)。

2.2 檢查

2.2.1 一般項(xiàng)目 膠囊劑的水分、裝量差異、崩解時(shí)限、重金屬、微生物限度檢查按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄[1]進(jìn)行,均符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 砷鹽 取3批樣品,按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄ⅦJ第一法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,砷在樣品中含量均＜1 ppm。

2.3 含量測(cè)定 丹參酮ⅡA、丹酚酸B遵照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)中規(guī)定的方法[1];丹參素按照《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部中規(guī)定的方法[2];原兒茶醛按照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)《WS-10149 (ZD-0149)-2002丹參顆?！分幸?guī)定的方法;隱丹參酮參照有關(guān)文獻(xiàn)辦法,分別進(jìn)行含量測(cè)定[3]。

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別按照文獻(xiàn)辦法制備丹參酮ⅡA含量為16μg·mL-1、隱丹參酮和丹酚酸B含量各為10μg·mL-1、丹參素鈉含量為100μg·mL-1(相當(dāng)于丹參素90μg·mL-1)和原兒茶醛含量為5μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 取10粒丹參膠囊內(nèi)容物,精密稱定、研細(xì)、混勻,取約0.3 g,精密稱定,置磨口錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,塞緊,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷后,密塞,稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得丹參酮ⅡA供試品溶液提取液。取本品內(nèi)容物約0.35 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加入流動(dòng)相約35 mL,超聲處理15 min,放冷,再用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得隱丹參酮供試品溶液。取本品內(nèi)容物約0.2 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加水適量,超聲處理20 min,放冷,加水至刻度,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液1 m L,置25 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得丹酚酸B供試品溶液。取本品內(nèi)容物約0.45 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相約15 mL,超聲處理15 min,放冷,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,2 000 r·min-1離心5 min,取上清液,即得丹參素供試品溶液。取本品內(nèi)容物約1.3 g,精密稱定,置50 m L量瓶中,加入流動(dòng)相約35 mL,超聲處理15 min,放冷,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得原兒茶醛供試品溶液。

2.3.1.3 陰性對(duì)照品溶液制備 如上法分別取空白膠囊內(nèi)容物約0.5 g,分別精密稱定,按法分別制備5種待測(cè)成分的陰性對(duì)照品溶液。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.3.2.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18stableBond Analytical(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫: 35℃。丹參酮ⅡA測(cè)定以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm,理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。隱丹參酮測(cè)定以乙腈-水(80∶20)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):263 nm,理論板數(shù)按隱丹參酮峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。丹酚酸B測(cè)定以甲醇-乙腈-冰醋酸-水(30∶10∶1∶59)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm,理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。丹參素測(cè)定以0.5%冰醋酸-甲醇(88∶12)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;理論板數(shù)按丹參素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。原兒茶醛測(cè)定以0.5%冰醋酸-甲醇(88∶12)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;理論板數(shù)按原兒茶醛峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。以上進(jìn)樣量均為20μL,流速均為1 mL·min-1。

2.3.2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 在上述各自色譜條件下,分別精密吸取5種成分的對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照品溶液各20μL注入液相色譜儀,記錄圖譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品的色譜圖中,分別有一個(gè)色譜峰與對(duì)照品色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間一致,陰性對(duì)照品在與對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上,色譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的吸收峰。結(jié)果理論板數(shù)、分離度和拖尾因子均符合要求,在各自色譜條件下,樣品得到良好分離。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別配制質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA為204.6μg·mL-1、隱丹參酮為59.29μg·mL-1L、丹酚酸B為60.102μg·mL-1、丹參素為459.582 3μg·mL-1和原爾茶醛為123.48μg·mL-1的對(duì)照品貯備液,然后再用各自溶劑稀釋成不同質(zhì)量濃度的的測(cè)試液,進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜峰面積。分別以峰面積(Y)對(duì)照品質(zhì)量濃度(X,μg·mL-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 5種成分線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Experimental result of linear relation of five kinds of constituents

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取丹參酮ⅡA對(duì)照品10.23 mg,置50 mL量瓶中,甲醇超聲溶解稀釋至刻度。搖勻,精密吸取2 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。取隱丹參酮對(duì)照品10.89 mg,流動(dòng)相稀釋1 000倍。取丹酚酸B對(duì)照品12.60 mg,流動(dòng)相稀釋1000倍。取丹參素鈉對(duì)照品10.42 mg,流動(dòng)相稀釋100倍。取原爾茶醛對(duì)照品12.60 mg,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相超聲溶解并稀釋至刻度。搖勻,精密吸取1 mL,置100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。分別吸取上述對(duì)照品溶液各20μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果丹參酮ⅡA對(duì)照品峰面積平均值為2 041.94,RSD為0.25%;隱丹參酮對(duì)照品峰面積平均值為1 223.27,RSD為0.04%;丹酚酸B對(duì)照品峰面積平均值為299.75,RSD為0.24%;丹參素對(duì)照品峰面積平均值為1459.90,RSD為0.21%。原爾茶醛對(duì)照品峰面積平均值為448.67,RSD為0.07%。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)120901丹參膠囊,平行取樣品各6份,精密稱定,依法分別配制成丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含量。結(jié)果丹參酮ⅡA的RSD為0.85%、隱丹參酮的RSD為0.88%、丹酚酸B的RSD為0.89%、丹參素的RSD為0.82%、原爾茶醛的RSD為0.92%。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)120903供試品適量,分別配制5種成分的供試品溶液,置棕色量瓶中密閉保存,常溫下分別于0,2,4,6,8 h,按各自色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算峰面積和RSD。結(jié)果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的峰面積RSD分別為0.82%,0.54%,1.46%,0.39%和0.84%。說(shuō)明5種成分的溶液在避光密閉容器中保存,含量變化不大,比較穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取丹參膠囊供試品(已知丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.24%,0.15%,5.08%,0.53%, 0.02%)各9份,平均分成3組。分別精密添加不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液,每個(gè)梯度平行3份;然后按“2.3.1.2”項(xiàng)方法制備樣品溶液,按法處理并測(cè)定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 取3批丹參膠囊,分別按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按相應(yīng)的色譜條件對(duì)供試品進(jìn)行丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的含量測(cè)定(每批3次),用外標(biāo)法計(jì)算,取均值。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 丹參膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù) 丹參含有以丹參酮為主的脂溶性成分和以酚酸為主的水溶性成分,其中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量較高,分別為藥材的0.1%～0.9%和2%～8%,成為丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)[4-5]。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)規(guī)定丹參藥材用高效液相色譜法測(cè)定,含丹參酮ⅡA(C19H25O3)應(yīng)不得少于0.20%,丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0%[1]。以丹參單味藥材和以丹參為主藥開發(fā)的復(fù)方制劑劑型多達(dá)十余種,該類制劑廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病的臨床治療。但丹參制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直存在某些爭(zhēng)議[6],一般是針對(duì)不同提取方法、生產(chǎn)工藝和劑型的產(chǎn)品,圍繞著水溶性酚酸類和脂溶性菲醌類兩大類型活性成分開展質(zhì)量控制。例如丹參片規(guī)定測(cè)定丹酚酸B的含量(每片折合質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)于3.67%);復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參顆粒都以丹參酮ⅡA和丹酚酸B作為含量測(cè)定指標(biāo)[1];而丹參顆粒、丹參合劑、丹參口服液、丹參注射液等則以原兒茶醛為質(zhì)量控制成分[7],丹參滴丸則以丹參素為控制對(duì)象。丹參膠囊則除了采用薄層色譜法定性丹參酮ⅡA外,還同時(shí)采用高效液相色譜法測(cè)定丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的含量,質(zhì)量控制兼顧丹參膠囊的水溶性和脂溶性兩大類主要活性成分。測(cè)定結(jié)果表明,除原兒茶醛含量較低之外,其他4種活性成分含量均相對(duì)較高,且與丹參原料藥的成分含量分布比較一致,較單純選擇丹參酮ⅡA和丹酚酸B控制制劑質(zhì)量更客觀,更實(shí)用。關(guān)于限量標(biāo)準(zhǔn),仍然建議以《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)中相同或者相似劑型的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為參考來(lái)制定。為更好地進(jìn)行質(zhì)量控制,筆者下一步擬對(duì)該品種的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入研究。

表2 5種成分加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests on five kinds of constituents

續(xù)表2 5種成分加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests on five kinds of constituents

表3 丹參膠囊樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of conten t determ ination on sam p les of Danshen capsules %,±s

表3 丹參膠囊樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of conten t determ ination on sam p les of Danshen capsules %,±s

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3.2 丹參膠囊與丹參舒心膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的比較 丹參舒心膠囊也是單味丹參藥材提取物制得的膠囊劑,原為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第7冊(cè)所收載,其主要是提取脂溶性部位入藥,標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡(jiǎn)單,關(guān)鍵項(xiàng)目為丹參酮ⅡA薄層層析鑒別,沒(méi)有含量測(cè)定[8]。由于該產(chǎn)品開發(fā)較早,丹參提取物的工藝過(guò)于簡(jiǎn)單,設(shè)計(jì)上也存在一些缺陷,因而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,含量差異懸殊[9]。因?yàn)槿狈Χ繕?biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致國(guó)內(nèi)對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法多種多樣,存在定量指標(biāo)難以統(tǒng)一的問(wèn)題[10-15]。而丹參膠囊是研究者根據(jù)[Z]GPH3-1《中藥、天然藥物制劑研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(第二稿)的相關(guān)規(guī)定,在參閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,采用丹參藥材脂溶性和水溶性有效部位均入藥的思路研制而成,較好地提升了制劑的質(zhì)量。因此,筆者認(rèn)為,在理想狀態(tài)下,既然現(xiàn)有的技術(shù)工藝已經(jīng)完全能夠滿足同時(shí)提取丹參的兩大類有效成分,丹參藥材作為單一入藥的原料,其制劑應(yīng)該盡量參照《中華人民共和國(guó)藥典》中該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)制定,以確保臨床療效。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.027

Study on Quality Standard of Danshen Capsules

CHENG Yue-fa1,LAN Jian-fang2,REN Xin-ping2,ZHANG Jun1,XIE Yue-sheng1
(1.Jitang College of Hebei United University,Tangshan 063300,China;2.Hainan Selection Pharmaceutical Co.,Ltd,Haikou 571124, China)

ObjectiveTo establish a new quality control standard fordanshencapsules.MethodsThe qualitative identification ofdanshencapsules was characterized by ultraviolet fluorescence and thin-layer chromatography(TLC).The contents of tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensuand protocatechuic aldehyde indanshencapsuleswere determined by high performance liquid chromatography(HPLC)on a C18column.The flow rate was 1 mL·min-1,and the column temperature was 35℃.ResultsThe HPLC linear ranges of tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensuand protocatechuic aldehyde were 2.046-40.92μg·mL-1,1.482 25-59.29μg·mL-1,1.502 55-60.102μg·mL-1,11.49-459.582μg·mL-1,and 0.617 4-24.696μg·mL-1,respectively,andrvalueswere 0.999 9.The average recoverieswere99.66%(RSD of 0.91%)for tanshinoneⅡA,99.26%(RSD of 0.88%)for cryptotanshinone,99.09% (RSD of 0.76%)for salvianolic acid B,100.51%(RSD of 0.62%)fordanshensu,and 100.62%(RSD of 0.82%)for protocatechuic aldehyde,respectively.The contents of the tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensushowed a certain high level in the 3 batches ofdanshencapsule samples,but protocatechuic aldehyde was low by comparison.ConclusionThe HPL Cmethod is proven to be sensitive,accurate,repeatable,and can be used for quality control of thedanshencapsules.

Danshencapsules;Quality standard;Active component;Chromatography,high performance liquid; Chromatography,thin-layer

R286;R927.11

A

1004-0781(2014)06-0785-05

2013-08-06

2013-11-20

*唐山市2013年科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展基金項(xiàng)目(13130298z)

程月發(fā)(1967-),男,安徽桐城人,博士,主要研究方向:天然產(chǎn)物藥理學(xué)。電話:0315-8114108,E-mail:arthurcyf@163.com。