內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在高糖誘導(dǎo)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞轉(zhuǎn)化中的作用

申紅遠，白 靜，湯 喆，梁 偉，馬清華，劉秀華，王 禹*

（解放軍總醫(yī)院：1老年心血管病研究所，4病理生理研究室，北京 100853；2解放軍第324醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400020；3臨沂市沂水中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，臨沂 276400）

血管鈣化在糖尿病和尿毒癥患者中十分常見，與心肌梗死、血管順應(yīng)性下降、血管成形術(shù)時夾層形成有關(guān)，血管鈣化也被認為是心血管疾病的重要危險因素之一[1,2]。鈣化的血管對血管舒張劑抵抗，比正常血管更加僵硬，更容易導(dǎo)致血栓形成和動脈粥樣硬化斑塊破裂。最近的研究表明，血管鈣化不是一個被動的、血管疾病終末期、退行性變的表現(xiàn)，是一個主動的受到精確調(diào)控的過程，和骨生成極為相似[3]。血管鈣化是在多種刺激因素下血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化（transformation）的過程[4]。VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）后堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，基質(zhì)小泡形成，表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），例如BMP2，以及骨基質(zhì)蛋白，如骨鈣素（osteocalcin bone Gla protein，BGP）、骨連蛋白（osteonectin）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein）[1]。高糖刺激可以引起VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化，引起成骨樣細胞標(biāo)志性分子核心轉(zhuǎn)染因子（Cbfα-1）和BGP表達升高，ALP活性增加[5]。高糖和葡萄糖代謝產(chǎn)物葡萄糖胺可以引起血管平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，與動脈粥樣硬化形成有關(guān)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），UPR包括IRE1α、XBP1和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）途徑[7]。VSMCs向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化的機制還未完全闡明，本實驗旨在揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑是否在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（PPA），D-Hanks液（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶、D-葡萄糖、D-甘露醇（Amresco公司），抗Cbfα-1抗體、抗p-PERK抗體、抗GRP78、抗BGP抗體購自（Santa Cruz公司），抗PERK抗體、抗eIF2α抗體、抗p-eIF2α抗體、抗ATF4抗體（CST公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗（北京中彬金橋生物科技有限公司），ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物公司），PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

植塊法進行大鼠胸主動脈VSMCs培養(yǎng)，方法簡述如下：健康雄性SD大鼠100g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼處死，無菌條件下迅速取出胸主動脈，立即移入有冰的含有無菌D-Hanks液的平皿中。剝離血管外的纖維脂肪組織，去除血管腔的血污，移入另一有冰的無菌D-Hanks液的平皿中，縱向剪開血管，用眼科彎鑷鈍頭輕刮血管腔內(nèi)膜面，分離血管中層平滑肌細胞，移入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將中膜剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，將組織塊轉(zhuǎn)移入25cm2塑料培養(yǎng)瓶瓶底，培養(yǎng)瓶預(yù)先用少許胎牛血清潤濕包被，組織塊擺置均勻，間距0.2～0.5cm翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加2～3ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，擰松培養(yǎng)瓶蓋，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中4～6h（如組織貼壁不牢可延長時間），待組織塊與瓶底貼附后，再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，注意操作輕柔，使培養(yǎng)液輕輕漫過組織塊，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱，絕對靜止培養(yǎng)5d，一般在5～7d見有細胞從組織塊邊緣長出，以后每3d換液1次。約2周組織塊周圍可爬滿細胞，細胞達到80%融合時即可傳代，0.125%胰酶（含EDTA）消化、傳代，取4～8代細胞用作實驗。培養(yǎng)的VSMCs傳至第2代時，用α平滑肌抗體（α-smooth muscle antibody，α-SMA）作為標(biāo)志分子進行免疫熒光染色鑒定。

實驗前24h更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，VSMCs隨機分為5組：（1）正常對照組（5mmol/L D-葡萄糖），細胞常規(guī)培養(yǎng)48或72h至實驗結(jié)束；（2）甘露醇組（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇），細胞培養(yǎng)48或72h至實驗結(jié)束；（3）高糖組（30mmol/L D-葡萄糖），高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48或72h至實驗結(jié)束；（4）高糖＋PERK-小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染組（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染前換OpitMEM培養(yǎng)液，采用Lipo2000陽離子脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4～6h后換高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48或72h至實驗結(jié)束；（5）高糖＋RNA干擾陰性對照組[30mmol/L D-葡萄糖＋亂序（scramble）RNA轉(zhuǎn)染]，將PERK-siRNA換為亂序RNA，余同組（4）。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）

采用TRIzol-A＋提取總RNA，Thermo NanoDrop 2 000分光光度計測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的18S條帶。按VigoScript第一鏈互補DNA（cDNA）合成試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，各目的基因上下游引物（P1，P2）見表1。PCR產(chǎn)物電泳圖像采用Image-Pro Plus4.1圖像分析軟件分析平均吸光度值，以目的片段和18S平均吸光度值的比值表示目的基因信使RNA（mRNA）的相對水平。

1.4 Western blot

收取各組第48和72小時細胞，采用RIPA蛋白提取液提取平滑肌細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后分裝，-80℃保存。各組樣品蛋白上樣量為80μg，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，相對分子質(zhì)量＞90ku為10%分離膠，而＜90ku為12%分離膠）。電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜上，5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉40min后分別加入抗GRP78、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、Runx2、α-SMA多克隆抗體（均為1∶500）、抗PERK多克隆抗體（1∶1000）4℃孵育雜交過夜，用1×TBS-T洗膜后以相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1h，以GAPDH（1∶1000）單克隆抗體重復(fù)上述實驗，作為上樣對照及內(nèi)參照?？乖?抗體復(fù)合物用ECL法顯示，暗室X線膠片曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的平均吸光度值，以目標(biāo)蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值反映目標(biāo)蛋白相對水平。

1.5 ALP活性檢測

ALP活性檢測試劑盒測定ALP活性。各組細胞干預(yù)48和72h結(jié)束后，收集細胞用冷PBS洗3次，加入150μl/孔（24孔板）0.05%的TritonX-100，超聲波破碎細胞10s，收集懸液，4℃12 000×g離心15min，上清即為待測樣本，蛋白用BCA法定量，各樣本按照說明書分別加入反應(yīng)試劑，紫外分光光度計測520nm處的吸光度值，將計算出的數(shù)值除以該樣品的蛋白含量，得到各樣本單位蛋白中ALP的活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗重復(fù)3遍，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差表示，采用SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間比較，多個樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR反應(yīng)目的片段引物Table 1 Primer sequence for PCR

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng)及其鑒定

VSMCs原代培養(yǎng)及其鑒定結(jié)果如圖1所示。

2.2 PERK-siRNA在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用

2.2.1 各組VSMCs Cbfα-1，ALP，BGP，α-SMA mRNA的表達變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，Cbfα-1、ALP、BGP mRNA表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，Cbfα-1，ALP，BGP mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖2～圖4）。各組間α-SMA mRNA表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖5）。

圖1 血管平滑肌細胞原代培養(yǎng)及其鑒定Figure 1 Primary culture and identification of vascular smooth muscle cells

圖2 各組細胞作用不同時間Cbfα-1，ALP，BGP和α-SMA mRNA的表達情況Figure 2 Expression of Cbfα-1, ALP, BGP and α-SMA mRNA in five groups at different time points

圖3 各組細胞作用不同時間Cbfα-1 mRNA的表達情況Figure 3 Expression of Cbfα-1 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖4 各組細胞作用不同時間ALP mRNA和BGP mRNA的表達情況Figure 4 Expression of ALP mRNA and BGP mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖5 各組細胞作用不同時間α-SMA mRNA的表達情況Figure 5 Expression of α-SMA mRNA in five groups at different time points(n＝3)

2.2.2 各組VSMCs Cbfα-1和α-SMA表達的變化 Western blot結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，Cbfα-1蛋白表達升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，Cbfα-1蛋白表達降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖6，圖7）。而α-SMA蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖8）。

2.3 PERK-siRNA在高糖誘導(dǎo)引起VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2.3.1 各組VSMCs GRP78，PERK，eIF2α，ATF4 mRNA的表達變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA表達升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA表達降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖9～圖13）。

2.3.2 各組VSMCs GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α，ATF4蛋白水平表達的變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白表達升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白表達降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖14～圖16，圖17～圖20）。

圖6 各組細胞作用不同時間Cbfα-1和α-SMA蛋白的表達情況Figure 6 Expression of Cbfα-1 and α-SMA protein in five groups at different time points

圖7 各組細胞作用不同時間Cbfα-1蛋白的表達情況Figure 7 Expression of Cbfα-1 protein in five groups at different time points(n＝3)

圖8 各組細胞作用不同時間α-SMA蛋白的表達情況Figure 8 Expression of α-SMA protein in five groups at different time points(n＝3)

圖9 各組細胞作用不同時間GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA的表達情況Figure 9 Expression of GRP78, PERK, eIF2α and ATF4 mRNA in five groups at different time points

圖10 各組細胞作用不同時間PERK mRNA的表達情況Figure 10 Expression of PERK mRNA in five groups at different time points(n＝3)

2.4 各組VSMCs ALP活性檢測

ALP檢測結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，ALP活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋亂序RNA相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，ALP活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；表2）。

圖11 各組細胞作用不同時間GRP78 mRNA的表達情況Figure 11 Expression of GRP78 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖12 各組細胞作用不同時間eIF2α mRNA的表達情況Table 12 Expression of eIF2α mRNA in five groups at different time points (n＝3)

3 討 論

血管鈣化是鈣鹽沉積在血管壁的一個主動的過程，和骨形成有許多相似之處。VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換在血管鈣化中發(fā)揮重要作用，VSMCs的成骨樣細胞表型一經(jīng)形成，鈣化促進因子Cbfα-1就會在血管平滑肌表達升高，Cbfα-1是成骨細胞標(biāo)志性分子，其出現(xiàn)也標(biāo)志著血管鈣化的起始步驟[8]。血管鈣化也和抑制血管鈣化的因子減少有關(guān)，這些因子包括：無機焦磷酸鹽、基質(zhì)Gla蛋白、骨橋蛋白、骨保護素、胎球蛋白、Smad6等[8]。

圖13 各組細胞作用不同時間ATF4 mRNA的表達情況Table 13 Expression of ATF4 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖14 各組細胞作用不同時間GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白的表達情況Figure 14 Expression of GRP78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α and ATF4 protein in five groups at different time points

圖15 各組細胞作用不同時間PERK蛋白的表達情況Figure 15 Expression of PERK protein in five groups at different time points(n＝3)

圖16 各組細胞作用不同時間GRP78蛋白的表達情況Figure 16 Expression of GRP78 protein in five groups at different time points(n＝3)

許多刺激因素可以導(dǎo)致VSMCs轉(zhuǎn)分化，如高糖、糖基化終末產(chǎn)物、高磷、堿性成纖維細胞生長因子、硬脂酸鹽、氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白、維生素D等[1,9?11]。本研究中發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑使VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化，VSMCs表達成骨樣細胞標(biāo)志物Cbfα-1，BGP，ALP升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK分子在發(fā)育過程中扮演重要角色，其功能缺失突變在人和小鼠會導(dǎo)致新生個體發(fā)育缺陷，如糖尿病、生長遲滯和多部位骨骼發(fā)育異常[12,13]。體外研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在骨組織和骨細胞發(fā)育成熟中起重要作用[14]。

在體外培養(yǎng)和一些心血管病理生理過程中，VSMCs會經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化。它們與其他肌細胞不同，是一種非終末分化細胞[14]。VSMCs是由間胚層分化發(fā)育而來，對于血管的收縮和舒張有著十分重要的作用。Cbfα-1又稱為Runx2，是成骨細胞發(fā)育分化的掌控因子，在骨形成中起關(guān)鍵作用，其在血管平滑肌細胞中表達升高被認為是向成骨樣細胞分化的明確的早期標(biāo)志[15]。Cbfα-1控制著其下游與成骨細胞發(fā)育分化有關(guān)的蛋白分子，如BGP、骨橋蛋白（osteopontin）和Ⅰ型膠原[16]。

圖17 各組細胞作用不同時間eIF2α蛋白的表達情況Table 17 Expression of eIF2α protein in five groups at different time points(n＝3)

圖18 各組細胞作用不同時間ATF4蛋白的表達情況Table 18 Expression of ATF4 protein in five groups at different time points(n＝3)

圖19 各組細胞作用不同時間p-PERK蛋白的表達情況Table 19 Expression of p-PERK protein in five groups at different time points (n＝3)

圖20 各組細胞作用不同時間p-eIF2α蛋白的表達情況Table 20 Expression of p-eIF2α protein in five groups at different time points(n＝3)

本實驗中我們用RNA干擾（RNA intenference，RNAi）技術(shù)干擾PERK的表達，成功地使其在高糖環(huán)境刺激下mRNA和蛋白質(zhì)水平表達降低，其激活形式——磷酸化的PERK也降低，同時其下游eIF2α在mRNA和蛋白水平也降低，磷酸化的eIF2α表達也下降，成骨樣細胞的標(biāo)志物Cbfα-1和BGP表達下降，ALP mRNA表達也下降。VSMCs在高糖刺激下，PERK-siRNA干預(yù)后其ALP活性下降。作為陰性對照的亂序RNA處理組同高糖組相比未見明顯差異。甘露醇組和正常對照組相比，未引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑表達改變，也未見成骨樣細胞標(biāo)志表達變化。

表2 各組細胞作用不同時間ALP活性檢測Table 2 The activity test of ALP in five groups at different time points(n＝3, U/g protein, ±s)

表2 各組細胞作用不同時間ALP活性檢測Table 2 The activity test of ALP in five groups at different time points(n＝3, U/g protein, ±s)

CON: normal control group; Mannitol: mannitol group; HG: high glucose group; HG＋PERK-siRNA: high glucose＋PERK-siRNA group; HG＋scramble RNA: high glucose＋scramble RNA group.Compared with CON, Mannitol, HG＋PERKsiRNA groups, *P＜0.05;compared with HG, HG＋scramble RNA groups, #P＜0.05

Group 48h 72h CON 72.00±3.62 75.00±3.35 Mannitol 70.00±3.91 72.00±3.78 HG 99.00±6.23* 113.00±5.79*HG＋PERK-siRNA 69.00±4.34# 83.00±4.45#HG＋scramble-RNA 99.00±6.25* 110.00±5.92*

血管鈣化的確切機制目前仍不十分清楚，但迄今認為其不是一個被動的鈣鹽沉積的過程，而是一個主動的、和骨形成有許多形似之處的可調(diào)控的過程。VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化這一細胞學(xué)行為在血管鈣化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。血管鈣化的關(guān)鍵問題是VSMCs由收縮表型向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化，而細胞表型轉(zhuǎn)化是細胞生物學(xué)的重大科學(xué)問題[17]。本實驗利用RNAi技術(shù)敲低PERK，成功闡明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮作用，并且干預(yù)PERK可以抑制這一轉(zhuǎn)分化的細胞生物學(xué)過程，有助于對血管鈣化這一病理生理現(xiàn)象進行干預(yù)，可以作為血管鈣化早期預(yù)防的靶點。

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