固相萃取技術(shù)在復(fù)方草珊瑚含片中異嗪皮啶定量分析中的應(yīng)用研究

包建民，高赫男，王琨，李優(yōu)鑫

(天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

固相萃取技術(shù)(SPE)是利用目標成分與其它成分在固定相上保留方式和能力的不同，達到分離、富集、純化的目的。主要優(yōu)點是能處理低濃度試樣;操作簡單快速，便于自動化;分離時間短;富集倍數(shù)高;有機溶劑的低消耗;方便試樣的儲存和運送等［1］。在環(huán)境、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域［2-5］，逐漸取代傳統(tǒng)方法，獲得廣泛應(yīng)用。目前，在美國、歐洲等發(fā)達國家，SPE已被列入行業(yè)標準［6-9］，基本取代傳統(tǒng)的預(yù)處理方法。

中藥制劑劑型多樣、樣品成分復(fù)雜、有效成分含量低、雜質(zhì)較多，使得中藥制劑的含量測定存在干擾多、方法專屬性和重復(fù)性不佳等問題，同時，容易污染儀器，降低儀器的使用壽命。因此，中藥制劑的預(yù)處理技術(shù)一直是中藥研究的重要內(nèi)容之一。

本文選取藥典［10］收載的采用液-液萃取預(yù)處理方法的復(fù)方草珊瑚含片作為研究對象，在藥典方法基礎(chǔ)上，建立基于SPE預(yù)處理技術(shù)的含量測定方法，并進行系統(tǒng)的方法學(xué)考察。通過與藥典方法的比較，評價SPE技術(shù)用于此藥品預(yù)處理的實用性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

異嗪皮啶標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110837-200304);江中牌復(fù)方草珊瑚含片(生產(chǎn)批號0512018);甲醇、乙腈均為色譜純;蒸餾水。

Waters 600s型高效液相色譜儀(包括616型泵，717型自動進樣器，486型紫外檢測器);DL-180A超聲清洗器;AL-104電子分析天平;SPE-C18小柱。

1.2 色譜條件

色譜柱 Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1% 磷酸水溶液(12.5∶87.5)，流速1 mL/min，檢測波長340 nm，柱溫室溫，進樣量 20 μL。

1.3 對照品溶液的配制

精密稱取一定量的標準品，加甲醇，制成38 μg/mL的對照品溶液，進一步稀釋，得一系列濃度的對照品溶液。

1.4 樣品液的配制

1.4.1 藥典法 按照2005年版中國藥典規(guī)定方法進行處理。取本品10片，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定，加水約10 mL，超聲處理(功率300 W，頻率25 kHz)10 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取5次，每次10 mL，離心收集合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

1.4.2 SPE 法

1.4.2.1 提取 復(fù)方草珊瑚含片研磨，過7#篩。精密稱取粉末0.80 g，精密加水8 mL，超聲處理30 min，離心3 min，轉(zhuǎn)速11 000 r/min，合并上清液。

1.4.2.2 固相萃取 取上清液1.0 mL，過 SPE 柱(經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水洗)用 10 mL水淋洗、5 mL 10%甲醇淋洗，以5 mL 50%甲醇洗脫，收集洗脫液，定容至 5.0 mL。經(jīng) 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，濾液進行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗及色譜條件優(yōu)化

根據(jù)分離度和保留時間，優(yōu)化流動相中磷酸和乙腈的濃度，確定流動相為乙睛∶0.1%磷酸=12.5∶87.5。

取樣品液，按1.2節(jié)進行系統(tǒng)適應(yīng)性實驗，重復(fù)進樣4次，色譜圖見圖 1，考察理論塔板數(shù)為34 000 塊/m，拖尾因子0.97，分離度為 2.4，RSD 為0.6%。處理后得到的樣品雜質(zhì)成分簡單，有效成分含量高。

圖1 標準品和樣品液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard and sample after SPE treatment

2.2 SPE洗脫條件優(yōu)化

按1.4.2節(jié)處理樣品，分別用5 mL不同濃度的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集水洗液和洗脫液，優(yōu)化洗脫條件。結(jié)果表明，5%，10%甲醇洗脫液中都檢測不到異嗪皮啶的色譜峰，15% ～50%甲醇洗脫液中都能檢測到異嗪皮啶譜峰。因此，采用將樣品通過活化的 SPE小柱后，依次用10 mL水和5 mL 10%甲醇淋洗，最后用5 mL 50%甲醇洗脫，定容至5 mL進行HPLC分析。

為了讓異嗪皮啶盡可能完全保留在SPE柱上，且便于操作，同時又不使所得溶液濃度過稀，影響檢測，故上樣1 mL。為了保證異嗪皮啶完全洗脫下來，并且為了換算方便，選用5 mL 50%甲醇洗脫。

2.3 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)藥典方法，常溫下10 mL水超聲提取，且超聲過程中溫度會升高，故不再考慮提取溫度和提取溶劑的影響，研磨后過7#篩，消除粒徑的影響。所以本文著重考慮提取時間的影響。

按1.4.2 節(jié)處理樣品，分別超聲處理 10，15，20，30 min，記錄峰面積，根據(jù)提取的效果以及穩(wěn)定性，超聲30 min結(jié)果最佳，故選用超聲時間為30 min。

2.4 繪制標準曲線

取對照品溶液，逐級稀釋得 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0 μg/mL 一系列濃度的溶液，分別進樣20 μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，異嗪皮啶濃度為橫坐標作圖，擬合回歸得回歸方程y=68 666x－7 046.1，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 6，線性范圍0.5 ～8.0 μg/mL。

2.5 精密度實驗

2.5.1 重復(fù)性 取藥典方法和SPE法制得的樣品液，分別進樣20 μL，重復(fù)3次，計算異嗪皮啶含量和日內(nèi)RSD(見表1)，SPE法日內(nèi)精密度優(yōu)于藥典方法。

2.5.2 日間精密度 分別于第1，3，5 d重復(fù)此實驗，計算日間RSD，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性符合分析要求。

由表1可知，藥典方法測得的異嗪皮啶含量略小于SPE方法，主要原因是藥典方法在樣品超聲處理后將混合物多次萃取處理，難免造成異嗪皮啶的損失;而SPE方法在樣品超聲處理后直接離心，上樣，沒有進行反復(fù)萃取處理，故減少了異嗪皮啶的損失。

表1 藥典方法和SPE方法的精密度Table 1 Precision of pharmacopoeia method and SPE method

2.6 回收率

2.6.1 絕對回收率 取1.96 μg/mL的對照品，按1.4.2.2節(jié)處理，記錄峰面積，重復(fù) 3次，計算絕對回收率為99.6%，表明所用SPE柱符合要求。

2.6.2 加樣回收率 按1.4.2.1節(jié)處理樣品，分別精密加入對照品適量，按1.4.2.2節(jié)實驗，同時做平行實驗，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 異嗪皮啶的加樣回收率Table 2 Recoveries of isofraxidin

由表2可知，平均加樣回收率在96.1% ～101.1%，表明分析方法準確。

3 結(jié)論

將固相萃取方法應(yīng)用到中藥復(fù)方制劑的前處理中，建立了基于固相萃取的復(fù)方草珊瑚含片含量測定方法，該方法分析準確、重復(fù)性好、系統(tǒng)適應(yīng)性高、除雜干凈、對檢測系統(tǒng)的污染少、與藥典方法比較，操作簡便快捷，避免了重復(fù)提取和高毒性有機溶劑氯仿的使用，整個前處理過程中所用有機溶劑少，環(huán)境友好。

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