對(duì)乙酰氨基酚SD大鼠毒代動(dòng)力學(xué)研究及P450的影響

郭秋平，楊 威，郭 琳，覃仁安，金若敏

藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）對(duì)患者的健康具有重要影響，DILI會(huì)影響藥物在臨床的使用，甚至藥物撤市。對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是臨床常用藥物，其肝毒性已有大量的報(bào)道［1－3］，APAP常用劑量小于2 g·d－1，若大于 4 g·d－1，可致肝損害，大于 10 g·d－1可致死亡。因此，美國(guó)食品藥品管理局（FDA）要求生產(chǎn)廠家修改藥品說(shuō)明書(shū)，標(biāo)明過(guò)量應(yīng)用APAP可導(dǎo)致肝臟毒性反應(yīng)。

肝細(xì)胞色素P450在藥物代謝中起著重要的作用。細(xì)胞色素酶P450廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織器官中，其中，肝臟和腸管含量最高［4］。約有20種細(xì)胞色素酶P450參與藥物的代謝，如果代謝某種藥物的酶缺乏或受抑制時(shí)，可表現(xiàn)為該藥物的血藥濃度升高，半衰期延長(zhǎng)，導(dǎo)致毒性反應(yīng)增加［5］。

本研究通過(guò)對(duì)SD大鼠P450的檢測(cè)，并結(jié)合APAP的毒代動(dòng)力學(xué)結(jié)果，分析藥物的毒性及體內(nèi)的蓄積情況，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 SD♀♂大鼠，體質(zhì)量200～240 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。將大鼠分為4組，即陰性對(duì)照組、APAP 189、567 mg·kg－1組以及肝細(xì)胞色素P450抑制劑西咪替丁組。每天給藥1次，連續(xù)14 d，陰性對(duì)照組給予超純水。

1.2 藥物及主要試劑 APAP：廣州白云山制藥股份有限公司白云山何濟(jì)公制藥廠提供，批號(hào)：20120801；APAP標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：100018－200408；西咪替丁片：廣東臺(tái)城制藥有限公司，批號(hào)：20130202。

1.3 方法

1.3.1 毒代動(dòng)力學(xué)研究

1.3.1.1 血漿樣品采集和前處理 給藥d 1、7、14，于給藥0、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h眼眶采集 0.5 ml全血，肝素抗凝，2 000×g離心，取上層血漿。取血漿0.2 ml，加入1.2 ml乙醚，渦旋2 min，2 000×g離心，取上層有機(jī)相1 ml于另一離心管。40℃水浴，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl純水溶解，取30 μl進(jìn)樣。

1．3.1.2 方法學(xué)驗(yàn)證 高效液相色譜法測(cè)定。色譜條件：色譜柱：迪馬 diamosil 250 mm×4.6 mm（5μm）。柱溫：25℃。流動(dòng)相：水（1%三乙胺）∶乙腈＝90∶10。流速：1.0 ml·min－1。檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。進(jìn)樣量：20μl。

1.3.1.2.1 專屬性考察 取6只大鼠的空白血漿樣品，加入APAP對(duì)照品，按照血漿處理方法處理?？疾炜瞻籽獫{樣品在APAP出峰時(shí)間是否有雜質(zhì)干擾，方法專屬性是否良好。

1.3.1.2.2 線性 配制濃度為1 g·L－1的母液，分別稀釋為 1 000、500、250、100、50、25、10 mg·L－1系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取以上系列濃度各20μl，加入空白血漿，配制成為終濃度 100、50、25、10、5、2.5、1 mg·L－1血漿工作曲線，按血漿樣品處理方法處理。

1.3.1.2.3 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密度用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD%）表示。取0.18 ml空白血漿，加入20μl APAP，配制成終濃度為 100、25、5 mg·L－1的血漿樣品，每個(gè)濃度5個(gè)樣品。精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于15%，在定量下限附近相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于20%。準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在定量下限附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)。

1.3.1.2.4 回收率試驗(yàn) 配制APAP終濃度為5、25、100 mg·L－1的血漿樣品，按血漿樣品處理方法進(jìn)行提取。提取后，檢測(cè)血漿樣品中APAP的響應(yīng)值，回收率計(jì)算方法為測(cè)定所得APAP的響應(yīng)值／血漿中已知量APAP的理論值×100%，回收率應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)。

1.3.1.3 質(zhì)量控制及樣品檢測(cè) 配制終濃度為5、25、100 mg·L－1的血漿樣品，經(jīng)前處理后平均分布于所有待測(cè)樣品中，QC樣品總數(shù)不少于5%。每日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線和QC樣品。

1.3.2 P450檢測(cè) 給藥14 d后，稱取2 g左右的肝臟，加入10 ml勻漿緩沖液或TMS緩沖液，將肝臟剪成細(xì)小碎塊，用玻璃勻漿器制成20%肝臟勻漿。

1.3.2.1 S9和肝臟微粒體的制備 將肝勻漿液2℃12 000×g高速離心20 min，所得上清液即線粒體后上清液。取適量線粒體后上清液，CaCl2沉淀法制備肝微粒體。每1 ml加入0.1 ml 88 mmol·L－1CaCl2溶液混勻，冰浴 5 min，2℃27 000×g離心15 min。棄上清，所得微粒體用Tris緩沖液清洗，沉淀用磷酸緩沖液重懸。

1.3.2.2 微粒體蛋白含量和細(xì)胞色素P450光譜測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定微粒體蛋白含量。光譜法測(cè)定細(xì)胞色素 P450：測(cè)定蛋白含量后，用 Tris緩沖液稀釋成10 g·L－1的蛋白懸液。取蛋白懸液0.3 ml，加Tris緩沖液5.7 ml混合，加入適量連二亞硫酸鈉，分裝于兩個(gè)比色杯，一為空白杯，另一為樣品杯，通入CO，1～2氣泡／s，2 min。分別于490及450 nm測(cè)定差示光譜。P450計(jì)算公式：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料的平均值用xˉ±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 毒代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 專屬性考察結(jié)果 對(duì)乙酰氨基酚保留時(shí)間為5.8 min，血漿中雜質(zhì)不干擾APAP的測(cè)定，該方法具有較高的專屬性。

2.1.2 血漿工作曲線 血漿工作曲線在1～100 mg·L－1范圍內(nèi)線性良好，Y＝2．20e4x－4．74e3r2＝0.997；定量下限為1 mg·L－1。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果 d 1、2、3，日內(nèi)精密度RSD分別為2.7%～10.7%、2.7%～7.2%、1.2%～8.4%，3 d的日內(nèi)精密度RSD為1.2%～10.7%，日間精密度RSD 2.2%～3.5%，均小于15%，符合要求。日間準(zhǔn)確度0.30%～10.00%。結(jié)果見(jiàn)Tab 1、2。

Tab 1 Precision test results of intra day（n＝5）

Tab 2 Precision test results of three days（n＝5）

2.1.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果 100、25、5 mg·L－1的血漿回收率分別為 98.4%、88.6%、93.8%，回收率為 88.6% ～98.4%，在80%～120%之間，符合要求。

方法學(xué)考察結(jié)果顯示專屬性良好，在1～100μg·L－1范圍內(nèi)線性良好，定量下限為1 mg·L－1，精密度、準(zhǔn)確度和回收率均達(dá)到要求，表明本方法可靠，可用于血漿樣品的檢測(cè)。

2.1.5 樣品測(cè)定結(jié)果 主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) AUC（0－t）、Cmax、Tmax。其中，AUC（0－t）由梯形法計(jì)算得到，Cmax、Tmax均以實(shí)測(cè)值表示。

APAP 189 mg·kg－1組給藥 d 1、7、14，AUC（0－t）分別為（208.6±63.7）、（150.9±102.4）、（214.8±78.5）mg·L－1·h；Cmax分別為（119.0±43.7）、（121.9±92.7）、（90.4±18.7）mg·L－1；Tmax分別為（0.4±0.3）h、（2.2±1.0）h、（0.6±0.7）h。APAP 567 mg·kg－1組給藥 d 1、7、14，AUC（0－t）分別為（783.6±163.1）、（982.3±317.9）、（1313.9±189.5）mg·L－1·h；Cmax分別為（161.2±43.4）、（209.0±116.3）、（259.3±51.7）mg·L－1；Tmax分別為（1.5±1.8）h、（1.4±1.4）h、（2.0±0.0）h。

APAP 567 mg·kg－1組給藥 d 14，AUC（0－t）、Cmax明顯增加，與給藥d 1相比，差異有顯著性（P＜0.05），提示藥物產(chǎn)生了蓄積。

2．2 P450檢測(cè)結(jié)果 給藥14 d后，P450抑制劑西咪替丁組P450明顯降低，論證了本試驗(yàn)系統(tǒng)合格。對(duì)乙酰氨基酚組P450含量降低，與陰性對(duì)照組相比，APAP 567 mg·kg－1P450含量降低，差異有顯著性，結(jié)果見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 APAP influence on the content of P450（ˉx±s，n＝6）

3 討論

APAP大鼠毒代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，在劑量567 mg·kg－1時(shí)，給藥14 d后，藥物在體內(nèi)產(chǎn)生了蓄積，對(duì)P450的總量也產(chǎn)生了抑制作用，推測(cè)P450代謝APAP的功能減弱，使藥物在體內(nèi)產(chǎn)生了蓄積。

目前，雖然APAP藥代動(dòng)力學(xué)的研究很明確，但通過(guò)本文的研究得出，APAP大劑量使用一段時(shí)間后，會(huì)產(chǎn)生抑制P450的作用，并引起藥物在體內(nèi)的蓄積，加劇藥物毒性。

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