ASIC1a對大鼠關節(jié)軟骨細胞基質代謝及MAPK信號通路表達的影響

張禮菊，胡 偉，唐 杰，吳繁榮，葛金芳，陳飛虎，吳建賢

酸敏感離子通道（acid-sesing ion channels，ASICs）是一類由胞外酸化后被H＋激活的陽離子通道，ASICs通道開放可導致胞外 Na＋、Ca2＋內流，并激發(fā)各種病理生理效應。其中，ASIC1a亞基因介導Ca2＋內流，并具有廣泛的生物學功能和重要的病理學意義，成為研究的熱點［1－2］。Xiong等［3］用特異性阻滯劑Psalmotoxin-1（PcTx-1）阻斷ASIC1a，發(fā)現(xiàn)其不僅特異性阻斷由ASIC1a介導的電流，而且能特異性抑制細胞內Ca2＋的超載，使腦缺血病灶模型的梗死體積明顯減小，敲除ASIC1a基因或用ASIC1a阻滯劑都可以保護缺血性腦損傷。本課題組前期研究證實，ASICs非特異性阻滯劑Amiloride通過阻斷酸敏感離子通道減輕關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨破壞，發(fā)揮關節(jié)軟骨保護作用［4］，但具體機制不清。

軟骨是關節(jié)內覆蓋骨骼末端的無血管組織，由于低氧和缺血導致軟骨處于一種偏酸性的生理狀態(tài)。關節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成。軟骨細胞僅占軟骨組織體積的3%，其主要功能是通過分泌II型膠原（主要成分為羥脯氨酸hydroxyproline，Hyp）、蛋白多糖（主要成分為糖胺聚糖glycosaminoglycan，GAG）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinas，MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinas，TIMPs），維持關節(jié)軟骨的完整性和功能性。軟骨基質的合成以及酶與酶抑制劑之間保持動態(tài)平衡，調節(jié)軟骨ECM的產生和破壞，以維持軟骨正常的代謝和功能。在關節(jié)炎的病理狀態(tài)下，由于軟骨細胞的無氧糖酵解以及關節(jié)細胞產生的炎癥因子，導致軟骨微環(huán)境進一步酸化，局部組織pH值最低可達6.0左右，胞外酸化對軟骨細胞基質代謝具有重要的影響［5－6］。那么，這種酸化對軟骨細胞代謝作用是如何發(fā)生的，是否與人體存在的酸感受器ASICs有關？

為此，本研究以大鼠關節(jié)軟骨細胞為試驗對象，從細胞和分子水平深入開展ASIC1a對大鼠關節(jié)軟骨細胞基質代謝以及細胞內MAPK信號通路表達的影響。旨在進一步探索ASIC1a在關節(jié)軟骨細胞功能和代謝中的作用，初步闡明阻斷ASIC1a對大鼠關節(jié)軟骨保護的細胞和分子機制，以豐富人們對ASIC1a功能的認識，為關節(jié)炎的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質量（160±20）g；由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。合格證號：皖醫(yī)實動準字第01號。

1.2 藥物與試劑 RNA引物，由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine 2000通用轉染試劑盒，Invitrogen公司產品；Syber Green染料，F(xiàn)ermentas公司產品；PcTx1，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；Amiloride，Sigma公司產品；ASIC1a siRNA，上海吉瑪制藥技術有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑，Roche公司產品；ASIC1a抗體，Santa Cruz公司；p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK（Thr180／Tyr182）（12F8）Antibody，Cell Signaling Technology公司產品；p44／p42 MAPK（ERK1／2）、Phospho-p44／p42 MAPK（ERK1／2）（Thr202／Tyr204）Antibody，CST公司產品；MMP-2、TIMP ELISA試劑盒，美國RD公司；羥脯氨酸標準品、硫酸軟骨素標準品，美國Sigma公司產品。

1.3 軟骨細胞的分離鑒定 按本實驗室常規(guī)方法進行大鼠關節(jié)軟骨細胞的分離［7］，將已經消毒的蓋玻片（20 mm2）置于培養(yǎng)皿（90 mm2）中，按 2×107·L－1的密度將軟骨細胞接種于培養(yǎng)皿中，5 d后，細胞爬片結束，常規(guī)操作，甲苯胺藍染色，Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細胞。

1.4 軟骨細胞酸化刺激和藥物處理 將軟骨細胞分組如下：pH 7.4正常組、pH 6.0組、pH 6.0＋Amiloride組（100μmol·L－1）、pH 6.0＋PcTx1組（100μg·L－1）、pH 6.0＋siRNA組。各組于給藥30 min后，加入pH 6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h，換回pH 7.4的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集上清，檢測阻斷ASIC1a對酸化引起的基質代謝變化的影響。

其次，MAPK信號通路表達試驗，細胞分組如下：pH 7.4正常組、pH 6.0組、pH 6.0＋PcTx1組（100μg· L－1），檢測酸化及阻斷 ASIC1a對p38MAPK、ERK1／2磷酸化的影響。

1．5 對二甲基亞甲藍分光法檢測大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中GAG的含量［8］收集軟骨細胞培養(yǎng)液，3 000 r·min－1離心，取上清液 500μl和 500μl木瓜蛋白酶緩沖液（木瓜蛋白酶20 mg、乙二胺四乙酸584.6 mg、半胱氨酸6 mg，溶于蒸餾水至50 ml體系）混合，55℃消化12 h后，取上清液200μl，加入2.5 ml對二甲基亞甲基藍溶液（16 mg對二甲基亞甲基藍、3.04 g甘氨酸、2.37 g氯化鈉、95 ml 0.1 mol·L－1HCl加雙蒸水至1 L，搖勻，調 pH 3.0），在波長525 nm處用分光光度計比色，讀取吸光度值，代入標準曲線，計算軟骨細胞培養(yǎng)液中GAG的含量。

1．6 氯胺T法檢測大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中Hyp的含量［9］精密吸取2 ml HCl（12 mol·L－1），加到含2 ml培養(yǎng)液的EP管中，110℃水浴12 h（將EP管中4 ml液體轉移至安瓿瓶中，拉絲封口），水浴后可見黑色殘渣，將濾紙剪成2 cm半徑大小，過濾，取濾液 2 ml，配制 12 mol·L－1NaOH溶液，調pH至6.5～7.0（可見培養(yǎng)液酸→中性→堿性），取上面調過pH值的濾液0.5 ml，依次加入2 ml異丙醇和0.5 ml氯胺T試劑（1.27 g氯胺T、50%異丙醇20 ml，加雙蒸水稀釋至 100 ml，搖勻），25℃放置 25 min，最后加入0.5 ml恩里克試劑（對二甲氨基苯甲醛15 g置于100 ml容量瓶中，用65 ml／35 ml異丙醇／高氯酸（2∶1）定容至100 ml，臨用前配制）混勻后，65℃水浴，顯色20 min，冷卻后，讀取560 nm吸光度。將吸光度值代入標準曲線計算軟骨細胞培養(yǎng)液中Hyp的含量。

1．7 ELISA法檢測大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中MMP-2、TIMP-2的含量 從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl；樣本孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50μl，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的OD值，繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線。將檢測的OD值代入標準曲線，計算軟骨細胞培養(yǎng)液中MMP-2、TIMP-2的含量。

1．8 Western blot檢測軟骨細胞 p38 MAPK和ERK1／2蛋白磷酸化水平 加入pH 6.0的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后，收集細胞，每瓶加入800μl強RIPA裂解液（含10%PMSF）裂解30 min，吹打將細胞轉移到1.5 ml EP管中，離心30 min，取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白與5×上樣緩沖液以4∶1的比例混合，100℃煮10 min變性。蛋白樣品進行 SDS-PAGE，電泳分離，經 PVDF膜轉移，5%脫脂奶粉封閉3 h，隨后加入一抗（1∶500）孵育。TBST洗去多余的一抗，加入相應二抗，孵育，漂洗，ECL發(fā)光顯影。結果用Image-Pro Plus處理。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件，實驗結果均以ˉx±s表示，所有統(tǒng)計分析均采用方差分析。各組數(shù)據(jù)運用單因素方差分析進行統(tǒng)計檢驗。

2 結果

2.1 軟骨細胞的分離鑒定 甲苯胺藍染色結果顯示：大鼠關節(jié)軟骨細胞爬片經染色后，軟骨細胞單層生長，細胞質染成淺藍色，細胞核染成深藍色，清晰可見1～2個核仁，細胞外基質為淺藍色（Fig 1A）。免疫組織化學染色結果顯示：大鼠關節(jié)軟骨細胞胞質被染成棕黃色，細胞相互接觸少的地方棕色較淡，細胞密集生長的地方棕色較深，并且細胞外也可見到棕色。表明在培養(yǎng)的大鼠關節(jié)軟骨細胞和細胞外基質中有Ⅱ型膠原表達，證實本研究中分離并傳代培養(yǎng)的細胞為關節(jié)軟骨細胞（Fig 1B）。

Fig 1 Identification of articular chondrocytes

2．2 ASIC1a對軟骨細胞GAG代謝的影響 結果如Fig 2所示，酸化刺激組關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)液中GAG的含量與正常組比較明顯下降（P＜0.01）；與酸化刺激組相比，ASIC1a特異性阻滯劑PcTx1（100 μg·L－1）和 ASIC1a siRNA可明顯增加 GAG的含量（P＜0.01）。ASICs非特異性阻滯劑 Amiloride（100μmol·L－1）也可明顯增加 GAG的含量（P＜0.01）。

Fig 2 Effect of ASIC1a on GAG levels in acid-induced articular chondrocytes by 1，9-dimethylmethylene blue spectrophotometric（ˉx±s，n＝6）

2．3 ASIC1a對軟骨細胞Hyp代謝的影響 結果如Fig 3所示，酸化刺激組大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)液中Hyp的含量與正常組比較明顯下降（P＜0.01）。與酸化刺激組相比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTx-1（100μg·L－1）和 ASIC1a siRNA可明顯增加 pH 6.0組抑制的Hyp含量（P＜0.01），ASICs非特異性阻滯劑 Amiloride（100μmol·L－1）也可明顯增加Hyp含量（P＜0.01）。

Fig 3 Effect of ASIC1a on Hyp levels in acid-induced articular chondrocytes by chloramine T method（ˉx±s，n＝6）

2．4 ASIC1a對軟骨細胞MMP-2和TIMP-2代謝的影響 對于MMP-2，結果如Fig 4所示，酸化刺激組大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中MMP-2的含量與正常組比較明顯下降（P＜0.01）。與酸化刺激組相比較，ASIC1a特異性阻滯劑 PcTx-1（100μg·L－1）組MMP-2含量明顯增加（P＜0.01），ASIC1a siRNA可增加MMP-2含量（P＜0.05），ASICs非特異性阻滯劑Amiloride（100μmol·L－1）可明顯增加MMP-2含量（P＜0.01）。

Fig 4 Effect of ASIC1a on MMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA（ˉx±s，n＝6）

對于TIMP-2，結果如Fig 5顯示：pH 6.0組大鼠關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中TIMP-2的含量與正常組比較明顯下降（P＜0.01），ASIC1a特異性抑制劑PcTx-1組（100μg·L－1）和ASIC1a siRNA可明顯增加TIMP-2含量（P＜0.01）。ASICs非特異性阻滯劑Amiloride（100μmol·L－1）組可明顯增加 TIMP-2含量（P＜0.01）。

2．5 ASIC1a對軟骨細胞 p38 MAPK和 ERK1／2磷酸化的影響 對于p38 MAPK，結果見Fig 6所示，酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞3h后，與正常組比較，酸化刺激組大鼠關節(jié)軟骨細胞p38 MAPK蛋白磷酸化明顯增加，且差異具有顯著性（P＜0.01）。與酸化刺激組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTx-1（100μg·L－1）組明顯抑制了酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞p38 MAPK蛋白磷酸化表達（P＜0.01）。

Fig 5 Effect of ASIC1a on TIMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA（ˉx±s，n＝6）

Fig 6 Analysis of effect of ASIC1a on p38 MAPK phosphorylation in articular chondrocytes（ˉx±s，n＝3）

對于ERK1／2，結果如Fig 7所示。酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞3 h后，與正常組比較，酸化刺激組大鼠關節(jié)軟骨細胞ERK1／2蛋白磷酸化明顯增加，且差異具有顯著性（P＜0.01）。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑 PcTx-1（100μg·L－1）預處理組明顯減少了酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞ERK1／2蛋白的磷酸化（P＜0.01）。

酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞3 h后，大鼠關節(jié)軟骨細胞檢測不到JNK磷酸化蛋白的表達。

3 討論

Fig 7 Analysis of effect of ASIC1a on ERK1／2 phosphorylation in articular chondrocytes（ˉx±s，n＝3）

軟骨細胞代謝異常在類風濕關節(jié)炎及骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨破壞的病理過程中起關鍵作用。軟骨組織是一種特殊的組織，由單一的軟骨細胞和ECM組成，細胞只占軟骨組織體積的3%，其余均為主要由Ⅱ型膠原（COII）、蛋白多糖（Acan）和水等組成ECM成分。成熟軟骨細胞本身的代謝非常活躍，維持關節(jié)軟骨的正常代謝，在軟骨形成、代謝以及修復中起著極其重要的作用。軟骨細胞可以合成膠原蛋白與蛋白多糖，以及其它ECM。同時，它還可以分泌多種炎癥性細胞因子，亦可產生MMPs和TIMPs。在正常生理狀況下，這些細胞因子、酶及酶抑制劑之間保持平衡，調節(jié)軟骨ECM的產生和降解，以維持正常的代謝和功能。但在關節(jié)炎等病理狀態(tài)下，軟骨細胞基質代謝異常，直接導致關節(jié)軟骨的結構和功能丟失。

組織酸化是導致軟骨細胞基質代謝異常的重要原因。軟骨細胞對細胞外酸化的應答一方面表現(xiàn)為膠原和蛋白多糖合成的減少，另一方面表現(xiàn)為相對提高MMPs活性，而后者可降低軟骨中的Ⅱ型膠原和蛋白多糖。近年的一些研究提示，MMPs幾乎能降解所有的細胞外結締組織基質。在正常情況下，其與TIMPs以1∶1不可逆結合，對MMPs起抑制作用，使ECM始終處于降解速度不快于更新速度。軟骨細胞能夠感受周圍環(huán)境的變化而不斷調整ECM的代謝活動。適當?shù)膒H值會促進關節(jié)軟骨細胞和胞外基質的代謝，不適當?shù)膒H值（pH小于7.0）不僅影響關節(jié)軟骨細胞的代謝，而且還能誘導分解基質的酶表達和活性，導致軟骨ECM的破壞［10］。

ASICs是一類由胞外酸化后被H＋激活的陽離子通道［1］。胞外酸化能激活ASICs各亞基的開放，影響 ASICs的轉運，導致細胞進行 Na＋、Ca2＋等離子轉運。內流的離子可能通過改變細胞內成分來調控細胞基質的代謝。本文前期研究證實，大鼠關節(jié)軟骨細胞存在ASIC1a表達，ASIC1a調控胞外酸化刺激的軟骨細胞內Ca2＋濃度變化，并影響胞外酸化刺激的關節(jié)軟骨細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，ASIC1a調控胞外酸化誘導的軟骨細胞MMP-2以及相應的TIMP-2的合成，并影響 GAG、Hyp的代謝和更新。pH 6.0酸化組明顯降低軟骨細胞培養(yǎng)基中GAG和Hyp的含量，與Wilkins等［11］研究胞外酸化對軟骨細胞基質代謝的作用結果相一致。此外，與正常組相比，胞外pH 6.0酸化刺激可使關節(jié)軟骨細胞MMP-2、TIMP-2含量分別下降51.39%、79.05%，而阻斷ASIC1a后，則可使MMP-2、TIMP-2的含量分別恢復至正常含量的71.79%、71.89%，提示ASIC1a激活可導致軟骨細胞分泌MMP-2和TIMP-2減少。其中，MMP-2的減少較為緩慢，而TIMP-2的含量則呈現(xiàn)快速下降，從而破壞MMPs和TIMPs間的平衡，導致MMPs含量水平相對增加，關節(jié)軟骨ECM降解加劇，阻斷ASIC1a可通過恢復MMPs和TIMPs的相對平衡，從而保護AA大鼠關節(jié)軟骨。

ASIC1a屬于鈣滲透性酸敏感離子通道，胞外酸化激活可介導ASIC1a通道開放，胞外Ca2＋內流，引發(fā)一系列生物學效應［12］。而Ca2＋作為細胞內的第二信使在信號傳導過程中有極其重要的作用，幾乎參與了人體生命的所有活動功能［13］。持續(xù)升高的胞質內Ca2＋可以激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路，觸發(fā)信號級聯(lián)放大，從而控制多種細胞的生物反應［14］。本研究中 Western blot結果表明，胞外酸化刺激的大鼠關節(jié)軟骨細胞磷酸化狀態(tài)的ERK1／2和p38 MAPK表達增強，而JNK的磷酸化蛋白無表達，提示MAPK家族中只有ERK1／2和p38 MAPK蛋白參與了ASIC1a介導的大鼠關節(jié)軟骨細胞信號傳導。

綜上所述，本研究證實大鼠關節(jié)軟骨細胞ASIC1a激活，可抑制軟骨細胞對基質的合成，導致MMPs與TIMPs的代謝失衡。因此，阻斷ASIC1a可通過抑制關節(jié)軟骨細胞基質代謝失衡，進而增加軟骨細胞對基質的合成，減少MMPs對軟骨基質的降解，抑制關節(jié)軟骨的損傷，恢復關節(jié)軟骨的結構和功能，從而保護關節(jié)炎關節(jié)軟骨。

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