菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選*

羅艷琴,馬云,宋路瑤,秦飛,范銀洲,侯連兵

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510515)

菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選*

羅艷琴1,馬云1,宋路瑤1,秦飛1,范銀洲2,侯連兵1

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510515)

目的 研究菝葜不同濃度乙醇提取物治療小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型的藥理作用,為確定菝葜最佳提取工藝提供參考。方法采用不同濃度乙醇制備菝葜提取物,觀察其對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽增生的影響。結(jié)果與模型對(duì)照組比較,高、中、低劑量菝葜70%乙醇提取物對(duì)小鼠耳腫脹度有顯著的抑制作用(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05),可明顯降低大鼠棉球肉芽腫增生(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01)。結(jié)論小鼠耳腫脹和大鼠棉球肉芽腫兩種模型證實(shí),菝葜70%乙醇提取物各劑量組的抗炎活性作用最好。

菝葜;乙醇提取物;腫脹,耳;肉芽腫

菝葜又名金剛藤,為百合科植物菝葜(Smilax china L.)的干燥根莖,其味酸、甘,性平,具有祛風(fēng)利濕、解毒散瘀的功效[1]。研究發(fā)現(xiàn),菝葜具有抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀、免疫抑制、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[2]。目前對(duì)菝葜提取物抗炎作用的報(bào)道多見(jiàn)于菝葜水煎液[3],菝葜50%,80%乙醇提取物[4],以及菝葜95%乙醇提取物[5]的抗炎藥理作用,常采用水提醇沉法[6]。而且對(duì)菝葜不同濃度乙醇提取物的最佳提取工藝的篩選研究多停留在正交設(shè)計(jì)含量測(cè)定階段[7-9],筆者未見(jiàn)菝葜不同濃度乙醇提取物抗炎療效的藥效學(xué)比較研究。筆者在本研究中通過(guò)比較菝葜不同濃度乙醇回流提取物對(duì)小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型的抗炎作用實(shí)驗(yàn),以期從抗炎藥效角度確立菝葜在現(xiàn)代中藥制劑中的最佳提取乙醇濃度,為進(jìn)一步研究菝葜提取、分離、純化工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(specefic pathogen free, SPF)級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠170只,雌性,體質(zhì)量180～220 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2011-0015,合格證號(hào):No.4402101912。SPF級(jí)昆明小鼠255只,雌性,體質(zhì)量18～22 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2011-0015,合格證號(hào): No.44002100000209。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,室溫18～22℃,相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 藥物與試劑 菝葜由湖北省藥材公司提供,經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院劉傳明教授鑒定為百合科植物菝葜的根莖。金剛藤膠囊(湖北福人藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20110318)。二甲苯(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào):20111225),戊巴比妥鈉(Merck公司,批號(hào):1212013),注射用頭孢美唑鈉(DAEWOONG公司,批號(hào):064065)。

1.3 儀器 KH-500B超聲波清洗器(昆山禾木創(chuàng)超聲儀器有限公司),升降恒溫水油浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),D2F-6050真空干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠),HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠),YP10002型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司),BA110S型電子分析天平(萬(wàn)分之一精確度,德國(guó)Sartorius),微量加樣器(Eppendorf公司),GZX-DH電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.4 菝葜不同濃度乙醇提取物受試藥物的制備

1.4.1 菝葜水提取物 取菝葜藥材,粉碎后過(guò)篩孔內(nèi)徑0.15 mm篩(100目)備用,稱取粗粉1 000 g,加8倍量水提取2 h,5倍量水提取2 h,5倍量水再提取1 h,合并濾液,靜置過(guò)夜,濾過(guò),50～60℃減壓濃縮得浸膏,每克浸膏相當(dāng)于原藥材21.22 g。

1.4.2 菝葜30%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,30%乙醇用量為8,5,5倍,提取時(shí)間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無(wú)醇味,得浸膏,每克浸膏相當(dāng)于原藥材50.46 g。

1.4.3 菝葜50%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,50%乙醇用量為8,5,5倍,提取時(shí)間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無(wú)醇味,得浸膏,每克浸膏相當(dāng)于原藥材51.38 g。

1.4.4 菝葜70%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,70%乙醇用量為8,5,5倍,提取時(shí)間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無(wú)醇味,得浸膏,每克浸膏相當(dāng)于原藥材51.56 g。

1.4.5 菝葜95%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,95%乙醇用量為8,5,5倍,提取時(shí)間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無(wú)醇味,得浸膏,每克浸膏相當(dāng)于原藥材50.84 g。

1.5 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實(shí)驗(yàn)

1.5.1 模型的制備 取雌性昆明小鼠,連續(xù)給藥3 d,于第4天灌胃給藥30 min后,以移液槍將二甲苯涂于小鼠右耳前后兩面各0.015 mL,每鼠右耳共0.03 mL;左耳做空白對(duì)照。20 min后處死小鼠,從耳廓基部剪下雙耳,并以直徑8 mm打孔器分別沿左右耳緣正中相同部位等面積打下兩圓形耳片,稱質(zhì)量[10]。

1.5.2 分組及給藥 將255只雌性昆明小鼠采用完全隨機(jī)分組方法分為17組:菝葜水提取物,30%, 50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低劑量組均分別灌胃給予46.8,23.4,11.7 g·kg-1藥物(按生藥量計(jì),即相當(dāng)于臨床等效劑量的4,2,1倍);金剛藤膠囊組以生藥量計(jì)23.4 g·kg-1,灌胃給予小鼠,相當(dāng)于臨床用量的2倍;模型對(duì)照組給予等體積純化水。每天1次,連續(xù)給藥3 d。

1.5.3 觀察指標(biāo) 用電子天平(精確度為萬(wàn)分之一)準(zhǔn)確稱左、右耳朵片質(zhì)量,計(jì)算耳腫脹度;小鼠處死后,腹部正中切開,立即摘取脾臟稱質(zhì)量,計(jì)算臟器指數(shù)。計(jì)算公式:耳腫脹度=右耳朵片質(zhì)量-左耳朵片質(zhì)量;脾臟指數(shù)(%)=(脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%。

1.6 大鼠棉球肉芽腫模型實(shí)驗(yàn)

1.6.1 模型的制備 取SD雌性大鼠,禁食不禁水12 h,3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)腹腔麻醉,剪除其下腹中部毛,以酒精消毒,在腹部正中切開1 cm開口,從切口向左側(cè)腹股溝塞入滅菌棉球1個(gè)[棉球質(zhì)量(50±1)mg,臨用前用注射器注入1 mg·(0.1 mL)-1頭孢美唑鈉],縫合腹壁皮膚,安爾碘皮膚消毒劑消毒術(shù)區(qū)[11]。

1.6.2 分組及給藥 將清醒后的雌性SD大鼠隨機(jī)分為17組:菝葜水提取物,30%,50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低劑量組均分別灌胃給予32.4,16. 2,8.1 g·kg-1藥物(按生藥量計(jì),即相當(dāng)于臨床等效劑量的4,2,1倍);金剛藤膠囊組以生藥量計(jì)16.2 g·kg-1灌胃給藥(相當(dāng)于臨床等效劑量的2倍);模型對(duì)照組給予等體積純化水。每天1次,連續(xù)給藥7 d。

1.6.3 觀察指標(biāo) 于給藥后第8天,3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,從原切口將棉球連同周圍增生的結(jié)締組織一起取出,剔除脂肪組織,恒溫干燥箱60℃放置24 h后,用電子天平精密稱質(zhì)量,減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫質(zhì)量。因動(dòng)物攝食量的降低或體質(zhì)量減輕亦可降低肉芽腫質(zhì)量,故應(yīng)按mg(肉芽腫)·(100 g)-1(體質(zhì)量)表示[12]。計(jì)算公式:肉芽腫凈質(zhì)量=(棉球肉芽腫質(zhì)量-植入棉球質(zhì)量)/7 d后大鼠的體質(zhì)量;肉芽腫抑制率(%)=(模型對(duì)照組肉芽腫平均凈質(zhì)量-給藥組肉芽腫平均凈質(zhì)量)/模型對(duì)照組肉芽腫平均凈質(zhì)量×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較,方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以二甲苯涂抹小鼠右耳正、反面20 min后,小鼠右耳充血腫脹明顯。由表1可知,與模型對(duì)照組比較,金剛藤膠囊組小鼠耳腫脹程度顯著改善(t=2.05,P＜0.05);70%乙醇提取物高劑量組(t=2.58,P＜0.05),中劑量組(t=2.28, P＜0.05),低劑量組(t=2.17,P＜0.05)小鼠耳腫脹被明顯抑制;菝葜水提取物高劑量組(t=-0.35,P＞0.05)、中劑量組(t=-0.13,P＞0.05)、低劑量組(t=-0.32,P＞0.05),30%乙醇提取物的高劑量組(t=1.37,P＞0.05)、中劑量組(t=0.60,P＞0.05)、低劑量組(t=0.24,P＞0.05),50%乙醇提取物的高劑量組(t=1.67,P＞0.05)、中劑量組(t=1.27,P＞0.05)、低劑量組(t=1.01,P＞0.05),95%乙醇提取物的高劑量組(t=1.52,P＞0.05)、中劑量組(t=1.60,P＞0.05)、低劑量組(t=1.49,P＞0.05)小鼠耳腫脹均未被明顯抑制。提示菝葜70%乙醇提取物抗炎活性作用最好。

肉眼觀察發(fā)現(xiàn),模型對(duì)照組小鼠脾臟明顯腫大。與模型對(duì)照組比較,金剛藤膠囊組(t=1.99,P＜0.05),30%乙醇提取物高劑量組(t=2.56,P＜0.05)、中劑量組(t=2.08,P＜0.05),50%乙醇提取物中劑量組(t=2.56,P＜0.05)、低劑量組(t=2.07,P＜0.05)和95%乙醇提取物低劑量組(t=2.49,P＜0.05)脾臟腫大均減少;50%乙醇提取物高劑量組(t=3.11,P＜0.01),70%乙醇提取物高劑量組(t=4.33,P＜0.01)、中劑量組(t=4.23,P＜0.01)、低劑量組(t=3.55,P＜0.01),95%乙醇提取物高劑量組(t=3.59,P＜0.01)、中劑量組(t=2.76,P＜0.01)脾臟腫大差異有統(tǒng)計(jì)意義;菝葜水提取物高劑量組(t=0.07,P＞0.05)、中劑量組(t=-0.15,P＞0.05)、低劑量組(t=-0.51,P＞0.05)和30%乙醇提取物低劑量組(t=1.53,P＞0.05)脾臟腫大被抑制不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)研究 與模型對(duì)照組比較,金剛藤膠囊組大鼠棉球肉芽腫增生(t=5.59,P＜0.01)明顯降低,而30%,50%,70%,95%乙醇提取物高、中、低劑量組大鼠棉球肉芽腫增生均被不同程度抑制,其中30%乙醇提取物的高劑量組(t=2.61,P＜0.05)、中劑量組(t=2.65,P＜0.05)、低劑量組(t=2.44,P＜0.05)及95%乙醇提取物低劑量組(t=2.4,P＜0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;50%乙醇提取物的高劑量組(t=4.22,P＜0.01)、中劑量組(t=4.1,P＜0.01)、低劑量組(t=3.91,P＜0.01),70%乙醇提取物的高劑量組(t=5.28,P＜0.01)、中劑量組(t=5.24,P＜0.01)、低劑量組(t=5.17,P＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,95%乙醇提取物的高劑量組(t=2.89,P＜0.01)、中劑量組(t= 3.17,P＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;70%乙醇提取物各劑量組療效均優(yōu)于50%乙醇提取物各劑量組。說(shuō)明70%乙醇提取物各劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的抑制作用最優(yōu)。菝葜水提取物高劑量組(t=1.45,P＞0.05)、中劑量組(t=0.62,P＞0.05)、低劑量組(t= 0.04,P＞0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

表1 菝葜不同溶劑提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹及脾臟指數(shù)的影響Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

表1 菝葜不同溶劑提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹及脾臟指數(shù)的影響Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別數(shù)量/只劑量/(g·kg-1)耳腫脹度/mg脾臟指數(shù)/%模型對(duì)照組15…5.98±3.820.40±0.12金剛藤膠囊組1523.43.62±2.66*10.34±0.07*1菝葜水提取物高劑量組1446.86.39±4.480.40±0.08中劑量組1323.46.14±3.140.40±0.08低劑量組1411.76.35±3.220.41±0.09菝葜30%乙醇提取物高劑量組1546.84.41±3.180.32±0.09*1中劑量組1523.45.29±3.750.34±0.06*1低劑量組1411.75.70±3.700.35±0.12菝葜50%乙醇提取物高劑量組1546.84.05±3.110.30±0.08*2中劑量組1423.44.49±2.920.32±0.05*1低劑量組1511.74.81±2.650.34±0.06*1菝葜70%乙醇提取物高劑量組1546.83.01±2.23*10.27±0.08*2中劑量組1523.43.35±2.77*10.27±0.05*2低劑量組1511.73.48±2.39*10.29±0.09*2菝葜95%乙醇提取物高劑量組1346.84.16±3.220.29±0.07*2中劑量組1523.44.13±3.220.31±0.09*2低劑量組1511.74.26±2.440.32±0.06*1

3 討論

炎癥通?？梢啦〕探?jīng)過(guò)分為急性炎癥和慢性炎癥。急性炎癥起病急驟,持續(xù)時(shí)間短,僅幾天到一個(gè)月,以滲出病變?yōu)槠涮卣?炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以粒細(xì)胞為主。慢性炎癥持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),常數(shù)月到數(shù)年,以增生、病變?yōu)橹?其炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)則以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主[13]。小鼠耳腫脹模型是急性炎癥模型的一種,常用二甲苯作為致炎劑來(lái)誘導(dǎo)小鼠耳腫脹,二甲苯局部刺激作用導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增高及滲出腫脹,引起急性炎癥。近幾年來(lái),小鼠耳腫脹模型已發(fā)展成為一類比較成熟的動(dòng)物炎癥模型,由于其操作簡(jiǎn)單,模型穩(wěn)定,常用來(lái)評(píng)價(jià)一些植物有效成分的抗炎活性[14]。大鼠棉球肉芽腫屬慢性炎癥模型,棉球肉芽腫病變以棉球?yàn)橹行?周圍有多量巨噬細(xì)胞、異物巨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等包繞,形成結(jié)節(jié)狀病灶,引起慢性炎癥。建立急性和慢性炎癥兩種經(jīng)典動(dòng)物模型,是研究菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)比較了菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性作用。發(fā)現(xiàn)菝葜乙醇提取物在抑制小鼠耳腫脹度和大鼠棉球肉芽腫增生的炎癥方面具有一定作用,表明菝葜制劑用于抗炎具備較好的藥理學(xué)基礎(chǔ)。對(duì)菝葜不同濃度乙醇提取物藥理作用結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析顯示:在對(duì)抗小鼠耳朵腫脹和大鼠棉球肉芽腫增生方面,均以菝葜70%乙醇提取物的抗炎作用更為明顯,這一結(jié)果可為后期繼續(xù)研究不同極性有機(jī)溶劑對(duì)菝葜提取物的分離、純化工藝提供藥理學(xué)參考依據(jù)。同時(shí),為適應(yīng)中藥現(xiàn)代化菝葜有效部位制劑的二次開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

表2 菝葜不同溶劑提取物對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

表2 菝葜不同溶劑提取物對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別數(shù)量/只劑量/ (g·kg-1) 24 h干燥后肉芽腫凈質(zhì)量/[mg·(100 g)-1]肉芽腫抑制率/ %模型對(duì)照組11純化水52.39±7.83*1…金剛藤膠囊組1116.233.85±4.21*135.50菝葜水提取物高劑量組1032.447.47±8.819.54中劑量組1016.250.27±8.434.01低劑量組108.152.27±7.190.19菝葜30%乙醇提取物高劑量組1032.443.52±8.50*216.98中劑量組1016.243.40±9.06*217.18低劑量組108.144.09±8.52*215.84菝葜50%乙醇提取物高劑量組1032.438.03±7.61*127.48中劑量組1016.238.45±8.31*126.53低劑量組108.139.08±6.77*125.38菝葜70%乙醇提取物高劑量組1032.434.46±6.23*134.16中劑量組1116.235.01±7.60*133.21低劑量組118.135.23±6.25*132.82菝葜95%乙醇提取物高劑量組832.441.94±11.47*120.04中劑量組1116.241.86±7.25*120.04低劑量組118.144.43±7.40*215.27

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.005

Screening of the Different Concentrations of Ethanol Extracts fromSmilax China for Its Antiinflammatory Activity

LUO Yan-qin1,MA Yun1,SONG Lu-yao1,QIN Fei1,FAN Yin-zhou2,HOU Lian-bing1
(1.Department of Pharmacy,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.School of Pharmacy, Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo study the effects of the different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon ear edema in mice and granuloma in rats,and to provide an evidence for optimizing the extraction process.MethodsEffects of different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon the xylene-induced ear edema in mice and the cotton ball-induced granuloma hyperplasia in rats were tested.ResultsCompared with the model controls,70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat high,mediumand lowdoses significantly inhibited ear edema in mice(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05) and reduced the granuloma hyperplasia in rats(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01).ConclusionThe 70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat three doses present the most active antiinflammatory effect,confirmed in both mice ear edema and rats granuloma models.

Smilax China;Ethanol extracts;Edema,ear;Granuloma

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)07-0858-05

2013-07-22

2013-08-25

*廣東省醫(yī)院藥學(xué)研究基金(奧賽康基金) (2014A14)

羅艷琴(1988-),女,江西南昌人,在讀碩士,主要研究方向:中藥藥理與藥劑。E-mail:lyq20080831@163.com。

侯連兵(1957-),男,湖南株洲人,博士生導(dǎo)師,主任藥師,主要研究方向:藥物設(shè)計(jì)與藥理學(xué)評(píng)價(jià)。電話:020-61642175,E-mail:hlianbing@163.com。