溫度對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞浮力的調(diào)控機(jī)制

周 貝,畢永紅,胡征宇(.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢430072；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 00049)

溫度對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞浮力的調(diào)控機(jī)制

周 貝1,2,畢永紅1*,胡征宇1(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢430072；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

為了探討溫度對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞浮力的調(diào)控機(jī)制,將銅綠微囊藻分別置于10、15、20、25、30℃條件下,利用改良的percoll密度梯度離心法測(cè)得細(xì)胞密度,計(jì)算出細(xì)胞浮力大小,同時(shí)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)比生長(zhǎng)速率、光合活性、NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性、糖含量、蛋白含量和漂浮細(xì)胞百分比.結(jié)果顯示,在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)(10～30℃),隨著溫度升高,銅綠微囊藻的漂浮細(xì)胞百分率增加,浮力變大;同時(shí),細(xì)胞內(nèi)糖含量減少,蛋白含量增加,光合作用和NAD(P)H 依賴型氧化還原脫氫酶活性增強(qiáng).10、15℃條件培養(yǎng)7d,細(xì)胞的密度分別增加了2.7%和1.3%,糖含量分別增加了95.3%和65.5%,漂浮細(xì)胞百分比分別降低了23.8%和18.3, NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性分別降低了23.8%和18.3%;而20、25和30℃條件培養(yǎng)7d,細(xì)胞的密度則分別減少了2.8%、3.8%和3.2%,糖含量分別減少了8.5%、2.9%和19.4%,漂浮細(xì)胞百分比分別增加了0%、7%和8.5%,NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性分別增加了0%、7%和8.5%.研究結(jié)果顯示:溫度主要通過(guò)影響銅綠微囊藻細(xì)胞的光合速率、生長(zhǎng)代謝速率和偽空胞含量來(lái)改變細(xì)胞密度實(shí)現(xiàn)浮力調(diào)節(jié).低溫下糖含量增加是浮力消失的主要原因,細(xì)胞漂浮與沉降的溫度閾值在15～20℃之間.

溫度；細(xì)胞浮力；調(diào)控機(jī)制；銅綠微囊藻

銅綠微囊藻是一種常見(jiàn)的藍(lán)藻水華優(yōu)勢(shì)種[1-2],藻細(xì)胞所具備的浮力調(diào)節(jié)功能是其在不同水體中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的主要因素之一[3-4],浮力調(diào)節(jié)功能既可以使藻細(xì)胞進(jìn)入水體表層獲得充足的光照和 CO2[5-6],也可以使之進(jìn)入適宜的水體,獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-9].研究表明,冬季藍(lán)藻水華的消失、細(xì)胞沉降休眠及春季藍(lán)藻復(fù)蘇上浮與藍(lán)藻對(duì)溫度的響應(yīng)有關(guān),而夏季和初秋藍(lán)藻水華暴發(fā)與藍(lán)藻在高溫下具有相對(duì)較高的生長(zhǎng)速率有關(guān)[10-12],但關(guān)于溫度對(duì)藍(lán)藻的沉降、上浮的具體影響機(jī)制,仍缺乏清晰的認(rèn)識(shí).

藍(lán)藻浮力調(diào)節(jié)存在3種機(jī)制:細(xì)胞內(nèi)壓載物含量的改變、偽空胞的產(chǎn)生和稀釋、偽空胞的破裂[13-15].然而微囊藻偽空胞寬度窄小,強(qiáng)度大,細(xì)胞產(chǎn)生的膨脹壓無(wú)法使之破裂[14],因此,微囊藻的浮力調(diào)節(jié)機(jī)制為前2種.

藍(lán)藻細(xì)胞浮力調(diào)節(jié)研究已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,涉及營(yíng)養(yǎng)、光照和溫度等諸多因子對(duì)浮力調(diào)節(jié)的影響.營(yíng)養(yǎng)方面,藻細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)富足時(shí)保持浮力;在氮限制時(shí)由于偽空胞破裂和碳水化合物的累積而失去浮力;但在磷限制條件下,即使細(xì)胞內(nèi)偽空胞含量有所下降,細(xì)胞依然保持浮力[9].營(yíng)養(yǎng)對(duì)細(xì)胞浮力的調(diào)控往往與光照結(jié)合在一起進(jìn)行探討,光強(qiáng)對(duì)細(xì)胞浮力的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16],不同光強(qiáng)和光暗周期決定了氮、磷和碳對(duì)藻細(xì)胞浮力的影響.藻細(xì)胞只在光照充足的水體中(表層和營(yíng)養(yǎng)豐富的溫躍層間)上下移動(dòng)[16].

光對(duì)浮力調(diào)節(jié)的研究表明,藻細(xì)胞浮力對(duì)不同光強(qiáng)[17]和不同光周期的響應(yīng)不同,細(xì)胞的響應(yīng)時(shí)間、偽空胞的合成與稀釋、偽空胞的破裂和碳水化合物的累積與消耗等過(guò)程均顯著受到光的影響,導(dǎo)致在低光強(qiáng)下浮力增加,高光強(qiáng)下浮力降低.而且,研究表明,細(xì)胞浮力對(duì)光的具體響應(yīng)還依賴于試驗(yàn)前細(xì)胞所處的營(yíng)養(yǎng)和光照環(huán)境[18].

Thomas等[19]研究了微囊藻細(xì)胞浮力在不同溫度下恢復(fù)的情況,結(jié)果表明,微囊藻細(xì)胞在高光強(qiáng)20℃或8℃失去浮力后,轉(zhuǎn)移到20℃黑暗條件下細(xì)胞重新獲得浮力,而轉(zhuǎn)移到 8℃黑暗條件下細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)浮力.適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下細(xì)胞能恢復(fù)其浮力調(diào)控能力,與適當(dāng)溫度下細(xì)胞的碳水化合物利用能力和偽空胞的合成能力密切相關(guān).金相燦也證實(shí)糖的積累使細(xì)胞密度增大是細(xì)胞在低溫條件下浮力下降的主要原因[12].

目前,營(yíng)養(yǎng)鹽、光照等條件對(duì)藍(lán)藻浮力調(diào)節(jié)的影響研究較多,而溫度對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞浮力調(diào)節(jié)的機(jī)理研究相對(duì)較少.本文通過(guò)改良的percoll密度梯度離心法獲得不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞的實(shí)際浮力,可避免借助其他工具和途徑計(jì)算浮力帶來(lái)的誤差;同時(shí)結(jié)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖含量、蛋白含量、光合作用和呼吸代謝的分析,以期直觀地揭示溫度對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞浮力的調(diào)控機(jī)制,探索溫度與浮力調(diào)節(jié)可能存在的內(nèi)在關(guān)系,為認(rèn)識(shí)和防控銅綠微囊藻水華提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB)提供,培養(yǎng)液為BG11培養(yǎng)液,其組成為1L去離子水中含有1.5g的NaNO3,40mg的K2HPO4,75mg的MgSO4?7H2O,36mg的CaCl2?2H2O,6mg檸檬酸,6mg檸檬酸鐵,1mg EDTANa2,20mgNa2CO3,2.86g的H3BO3,1.86g的MnCl2?4H2O,0.22g的ZnSO4?7H2O, 0.39g的Na2MoO4?2H2O,0.08g的CuSO4?5H2O,0.05g的Co(NO3)2?6H2O,最后調(diào)節(jié)pH值至7.1.

1.2 擴(kuò)大培養(yǎng)

取出保存的銅綠微囊藻藻種,將其轉(zhuǎn)移到1000mL錐形瓶?jī)?nèi)(有500mLBG11培養(yǎng)液),在溫度為 25℃,光照強(qiáng)度為 50μmol/(m·s),光暗比為12h:12h的條件下,進(jìn)行 2～3次的擴(kuò)大培養(yǎng),當(dāng)藻類(lèi)生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后,收集細(xì)胞用于接種.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

將銅綠微囊藻置于 500mL三角瓶中(300mLBG11培養(yǎng)液),分別在不同溫度下(5個(gè)溫度梯度,分別為10、15、20、25、30℃)進(jìn)行培養(yǎng),光照強(qiáng)度為50μmol/(m.s),光暗比為12h∶12h,接種量為5×104cells/mL,每組設(shè)置3個(gè)平行.

1.4 比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

測(cè)定完光合活性的樣品取1mL用于測(cè)定細(xì)胞數(shù)量,采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定.然后根據(jù)下式計(jì)算比生長(zhǎng)速率:

式中:X1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)開(kāi)始時(shí)細(xì)胞數(shù)量;X2為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)量;t2-t1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間.

1.5 光合活性測(cè)定

自接種后第1d起,每天取3mL藻樣,使用浮游植物熒光儀(water-PAM 德國(guó))檢測(cè)銅綠微囊藻細(xì)胞光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)在飽和脈沖光強(qiáng)下葉綠素?zé)晒庵档淖兓?得到PSⅡ的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和電子傳遞速率ETR[20].

1.6 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性

活細(xì)胞的NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶在代謝過(guò)程中將MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物-甲臢晶體,晶體生成的量與活細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活化狀態(tài)呈正相關(guān).而喪失 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性的死細(xì)胞不能轉(zhuǎn)化MTT,因此MTT陽(yáng)性細(xì)胞含量的多少可以反映細(xì)胞的死活和細(xì)胞中NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶代謝活性的高低[22],而 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性的高低又反映了細(xì)胞呼吸代謝的強(qiáng)弱.測(cè)定完光合活性的樣品取250μL藻液樣品,加入60μLMTT染液,35℃水浴下,反應(yīng)4h,然后鏡檢計(jì)數(shù),得到MTT陽(yáng)性細(xì)胞比例[23].

1.7 糖含量和蛋白質(zhì)含量

細(xì)胞內(nèi)糖含量采用苯酚硫酸法.每天取8mL藻樣,3000r/min離心15min棄上清,藻體研磨后于沸水水浴1h,3000r/min離心15min并收集上清液.吸取 2mL上清液,放入具塞試管中,加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL,搖勻,放置30min,在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度.

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定.每天取8mL藻樣,3000r/min離心15min棄上清.藻體加入液氮后進(jìn)行研磨,反復(fù) 6～8次以充分提取蛋白質(zhì).3000r/min離心15min并收集上清液,吸取1mL上清液,放入具塞試管中,加入 5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,作用5min,在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度.

1.8 漂浮細(xì)胞比例和浮力測(cè)定

漂浮細(xì)胞比例按照文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行.

自接種后第 1d起每天測(cè)定藻細(xì)胞的浮力.首先利用percoll密度梯度離心法測(cè)得細(xì)胞的密度,取 10mL的離心管,由下向上分別加入1mL85%、60%、35%、18%和2%的percoll工作液,密度分別為1.109、1.079、1.050、1.030、1.011g/mL,最后加入1mL藻液放置于最頂層,配平后2500r/min離心10min,離心結(jié)束后觀察細(xì)胞所在的percoll層,確定細(xì)胞密度.再通過(guò)浮力定律計(jì)算細(xì)胞浮力:

式中:ρ液為測(cè)量得到的培養(yǎng)過(guò)藻細(xì)胞的培養(yǎng)基密度約為 1.05g/mL;ρ物為測(cè)量所得的藻細(xì)胞密度;g為9.8N/kg;V物為細(xì)胞體積V=(4/3)π r3=3.6662×10-8cm3[25].r為細(xì)胞半徑,通過(guò)光學(xué)顯微鏡下測(cè)量得來(lái),40倍鏡下,一格測(cè)微尺長(zhǎng)度為2.5μm,測(cè)量 1000個(gè)細(xì)胞求平均值.當(dāng) F浮為正值時(shí),表明細(xì)胞受到的力向上,細(xì)胞上浮.當(dāng)F浮為負(fù)值時(shí),表明細(xì)胞受到的力向下,細(xì)胞下沉.

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)spss13.0進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)和相關(guān)分析,當(dāng) P<0.05時(shí)數(shù)據(jù)差異顯著或顯著相關(guān);P<0.01時(shí)數(shù)據(jù)差異極顯著或極顯著相關(guān).

2 結(jié)果

2.1 比生長(zhǎng)速率

圖1 不同溫度下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Microcystis aeruginosa at different temperature

不同溫度條件下藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖 1.比生長(zhǎng)速率隨溫度升高而逐漸增大,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).10℃時(shí)藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率為零,細(xì)胞停止生長(zhǎng),當(dāng)溫度達(dá)到 15℃時(shí)比生長(zhǎng)速率為0.09,細(xì)胞開(kāi)始緩慢生長(zhǎng),當(dāng)溫度高于20℃時(shí),微囊藻細(xì)胞快速生長(zhǎng)增殖,細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng).

2.2 光合活性的變化

圖2 不同溫度下藻細(xì)胞PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv /FmFig.2 Fv /Fm of Microcystis aeruginosa at different temperature

圖3 不同溫度下藻細(xì)胞電子傳遞速率ETRFig.3 ETR of Microcystis aeruginosa at different temperature

高溫(20～30℃)處理組的藻細(xì)胞最大光化學(xué)效率 Fv/Fm和電子傳遞速率 ETR均高于低溫(10～15℃)處理組(圖 2、圖 3),且兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).這說(shuō)明高溫下細(xì)胞光合能力較強(qiáng),可產(chǎn)生更多的光合產(chǎn)物—碳水化合物.

2.3 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性

高溫(20～30℃)下 MTT陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于低溫(10～15℃)條件(圖 4),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).高溫培養(yǎng)下的藻活細(xì)胞較多,其 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性強(qiáng),呼吸代謝活動(dòng)旺盛;低溫下藻細(xì)胞 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性弱,顯示細(xì)胞活性較差.

圖4 不同溫度下銅綠微囊藻MTT陽(yáng)性細(xì)胞比例Fig.4 MTT positive cells ratios of Microcystis aeruginosa at different temperature

2.4 糖含量與蛋白含量的變化

圖5 不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)糖含量變化Fig.5 Variations in sugar content of Microcystis aeruginosa at different temperature

隨著溫度升高,藻細(xì)胞內(nèi)糖含量逐漸減小.在低溫(10、15℃)下細(xì)胞內(nèi)糖含量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而增加,7d內(nèi)分別增加了1.96倍和1.66倍.高溫下(20℃、25℃、30℃)細(xì)胞內(nèi)糖含量下降(圖5),7d內(nèi)分別減少8.5%、5%和19.5%,第7d時(shí)高溫和低溫下細(xì)胞內(nèi)糖含量差異顯著(P<0.01),10℃培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)糖含量是30℃培養(yǎng)組的1.851倍.通過(guò) pearson相關(guān)分析得到,細(xì)胞內(nèi)糖含量和溫度呈極顯性負(fù)相關(guān)(P<0.01).

隨著溫度升高,藻細(xì)胞內(nèi)蛋白含量逐漸增大（圖6）.低溫條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白含量呈下降趨勢(shì),在高溫條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白含量明顯升高,第7d時(shí)高溫和低溫條件下蛋白含量具有顯著差異(P<0.05).通過(guò)pearson相關(guān)分析得到,蛋白含量與溫度呈極顯性正相關(guān)(P <0.01).

圖6 不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)蛋白含量變化Fig.6 Variations in protein content of Microcystis aeruginosa at different temperature

2.5 漂浮細(xì)胞比例

圖7 不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞漂浮細(xì)胞比例變化Fig.7 Variations in floating percentage of Microcystis aeruginosa at different temperature

高溫(20～30℃)下漂浮細(xì)胞比例顯著高于低溫(10～15℃)下漂浮細(xì)胞比例(圖 7),并且高溫下漂浮細(xì)胞比例(>50%)幾乎保持不變,表明細(xì)胞浮力始終存在.當(dāng)溫度低于 15℃時(shí),漂浮細(xì)胞比例開(kāi)始明顯下降(<50%),表明細(xì)胞浮力逐漸喪失.通過(guò)配對(duì) t檢驗(yàn)得出,高溫條件下的漂浮細(xì)胞比例與低溫條件下的呈極顯著差異(P<0.01).由此進(jìn)一步證明,溫度對(duì)浮力影響的閾值在 15～20℃之間,溫度低于 15℃銅綠微囊藻趨于下沉,溫度高于20℃銅綠微囊藻趨于上浮.

2.6 浮力的變化

圖8 不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞密度和浮力的變化Fig.8 Variations in density and buoyancy of Microcystis aeruginosa at different temperature

隨著溫度升高,藻細(xì)胞密度減小,浮力增加(圖8),通過(guò)pearson相關(guān)分析得到,細(xì)胞浮力與溫度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01).在低溫(10～15℃)條件下,隨著天數(shù)增加,藻細(xì)胞密度逐漸增大,浮力逐漸減小,而在高溫(20～30℃)條件下,隨著天數(shù)的增加,藻細(xì)胞密度逐漸減小,浮力逐漸變大.通過(guò)配對(duì) t檢驗(yàn),高溫下與低溫下的細(xì)胞浮力呈極顯著差異(P<0.01).這表明溫度對(duì)藻細(xì)胞浮力影響的閾值應(yīng)該在15～20℃之間.

3 討論

多年來(lái)溫度對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)與代謝的影響一直備受關(guān)注,在適宜溫度范圍內(nèi),溫度每提高10℃,藻細(xì)胞酶促反應(yīng)速度將提高1～2倍.當(dāng)溫度高于一定限度,酶活性不再增高,反而降低[26].因此,在適宜溫度范圍內(nèi),藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率隨著溫度升高而提高.研究表明,微囊藻的最適生長(zhǎng)溫度為28℃[27-30].袁麗娜等[27]發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻在低溫(10℃)環(huán)境中不增長(zhǎng)(μ<0.01)或處于負(fù)增長(zhǎng)(μ<0)狀態(tài);李闊宇等[28]研究表明,在15 ,30μmol/℃ (m.s)條件下,底泥中微囊藻復(fù)蘇開(kāi)始啟動(dòng),而存在于底泥中的微囊藻遷移至上層水體的最適條件為20 ,30μmol/℃ (m.s);Hua等[29]在洋河水庫(kù)的圍隔實(shí)驗(yàn)證實(shí),當(dāng)水溫為 26℃時(shí),最適宜于微囊藻的聚集、上浮而形成水華;劉玉生等[30]的研究表明微囊藻在 30～35℃時(shí)比生長(zhǎng)速率快速增加,35℃達(dá)到最大,但當(dāng)微囊藻生長(zhǎng)達(dá)到最大增殖后,細(xì)胞馬上開(kāi)始沉淀,溶液綠色消退,呈乳白色,因此微囊藻的最適生長(zhǎng)溫度為28℃.本研究獲得了相同的結(jié)論,低于15℃的處理對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)與代謝不利,高于20℃的處理有助于銅綠微囊藻保持正常生命活動(dòng);從結(jié)果來(lái)看,溫度對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)代謝的影響與溫度對(duì)細(xì)胞浮力的調(diào)節(jié)機(jī)制具有直接的相關(guān)關(guān)系.低溫(低于15℃)下,細(xì)胞比生長(zhǎng)速率小、涉及生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵酶活力低,光合作用獲取的能量大部分轉(zhuǎn)變?yōu)樘穷?lèi)物質(zhì)儲(chǔ)藏在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞密度相對(duì)較大,導(dǎo)致細(xì)胞浮力較小;另一方面,因?yàn)榧?xì)胞浮力較小,細(xì)胞無(wú)法到達(dá)理想的水域獲取生命活動(dòng)所必需的光照和營(yíng)養(yǎng),這種狀況進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞較低的生長(zhǎng)速率,限制了細(xì)胞的增殖和種群的增長(zhǎng).高溫(20～30℃)作用下,細(xì)胞比生長(zhǎng)速率較大,涉及生長(zhǎng)代謝和光合作用的關(guān)鍵酶活力高,光合作用產(chǎn)生了大量的碳水化合物,而較高的代謝速率及時(shí)消耗了大量的光合產(chǎn)物,為細(xì)胞的增殖和種群的增長(zhǎng)提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ),最終導(dǎo)致細(xì)胞密度減小,細(xì)胞浮力增加,使細(xì)胞種群可以漂浮在水體表面.Kromkamp等的研究證明,銅綠微囊藻的晝夜垂直遷移,是由于細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的累積和消耗,導(dǎo)致細(xì)胞密度和浮力快速改變,從而使細(xì)胞快速的進(jìn)行垂直遷移[31-33].金相燦等[12]的研究表明,溫度低于 13℃時(shí),水華微囊藻下沉趨于休眠,溫度升高至 13℃以上,水華微囊藻趨于復(fù)蘇和上浮,而在此過(guò)程中,糖的積累和消耗是水華微囊藻細(xì)胞浮力調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素.從前人的研究結(jié)果可以推斷,溫度對(duì)銅綠微囊藻的影響與其對(duì)細(xì)胞代謝速率的改變具有直接關(guān)系,細(xì)胞代謝以及相關(guān)胞內(nèi)胞外物質(zhì)的快速合成與降解利用是細(xì)胞上浮下沉的內(nèi)在原因,溫度作為外部力量改變了細(xì)胞的具體反應(yīng)進(jìn)程.

本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果基本一致,當(dāng)溫度低于15℃時(shí),銅綠微囊藻的生長(zhǎng)代謝速率減小,但此時(shí)細(xì)胞仍具有較高的光合作用,因此光合作用產(chǎn)生的糖類(lèi)物質(zhì)大大超過(guò)了細(xì)胞分裂需求,導(dǎo)致糖類(lèi)物質(zhì)累積,細(xì)胞密度增大,而此時(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白含量較低,意味著偽空胞所提供的浮力不足以抵消壓載物的累積,細(xì)胞開(kāi)始下沉.當(dāng)溫度低于10℃時(shí),藻細(xì)胞停止增長(zhǎng),死亡率增加,活細(xì)胞的生理生化活性降至最低,浮力減小,細(xì)胞下沉,在極低溫環(huán)境的影響下,細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài),以抵御外界不良環(huán)境.而在高溫作用下(20～30℃),細(xì)胞具有較高的生長(zhǎng)速率,較強(qiáng)的光合作用產(chǎn)生了大量的碳水化合物-糖類(lèi),為細(xì)胞的快速生長(zhǎng)增殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ),而較高的代謝速率及時(shí)分解了大量的糖類(lèi),產(chǎn)生了大量ATP,為細(xì)胞的快速生長(zhǎng)增殖提供了能量基礎(chǔ),細(xì)胞內(nèi)糖含量的減少,導(dǎo)致細(xì)胞密度減小,浮力增加.同時(shí)細(xì)胞中蛋白含量增多,偽空胞含量增加,偽空胞提供的浮力抵消了壓載物的累積,最終導(dǎo)致細(xì)胞上浮.自然水體中,當(dāng)春天溫度升高時(shí),水底沉積表面的溫度逐漸升高,藻細(xì)胞開(kāi)始復(fù)蘇,其生理生化活性緩慢恢復(fù),然后開(kāi)始利用光能源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行光合作用、呼吸作用和生長(zhǎng)分裂,以達(dá)到生物量的大量累積并在一定條件下形成群體.夏季時(shí),適宜的氣象和水文條件會(huì)導(dǎo)致已在水體大量累積的銅綠微囊藻群體上浮至水體表面聚集成肉眼可見(jiàn)的水華.由此可見(jiàn),溫度是控制銅綠微囊藻細(xì)胞上浮和下沉的重要因子,溫度對(duì)藻細(xì)胞浮力影響的闕值應(yīng)該在15～20℃之間,溫度低至 15℃以下,細(xì)胞下沉趨于休眠,溫度升高至20℃以上,細(xì)胞趨于上浮.

溫度對(duì)藻細(xì)胞浮力的調(diào)控首先表現(xiàn)為溫度改變了細(xì)胞的酶活性和代謝速率.Rubisco酶活性隨溫度升高而增加,不同溫度導(dǎo)致光合作用和呼吸作用產(chǎn)生和消耗碳水化合物的速率的差異,引起藻細(xì)胞密度的快速改變,從而改變了藻細(xì)胞浮力[34].此外,Rubisco的加氧酶活性與羧化酶活性對(duì)溫度的敏感程度不一樣,通常,Rubisco加氧酶/羧化酶活性的比值隨溫度的升高而增加[35].因此,隨著溫度的升高,藻細(xì)胞光合作用和光呼吸作用同時(shí)增強(qiáng),但是光呼吸作用加強(qiáng)的速率高于光合作用,也就是糖類(lèi)的消耗速率高于累積速率,最終導(dǎo)致藻細(xì)胞糖類(lèi)物質(zhì)含量減少,細(xì)胞密度減小,浮力增加.從本文結(jié)果分析可知,高溫條件下,銅綠微囊藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)Ⅱ活性較高(圖 2,圖3 ),其Rubisco酶活性高,光合作用較強(qiáng),因此產(chǎn)生了大量光合產(chǎn)物-糖類(lèi),而此時(shí)活細(xì)胞較多,其N(xiāo)AD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性較強(qiáng)(圖4),呼吸代謝活動(dòng)較為旺盛,分解了大量的碳水化合物,產(chǎn)生了大量的能量以滿足代謝需要.這也驗(yàn)證了高溫條件下,細(xì)胞內(nèi)糖含量減少,細(xì)胞密度減小,細(xì)胞浮力增加.而低溫條件下,銅綠微囊藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)Ⅱ活性相對(duì)降低(圖2,圖3), Rubisco酶活性降低,光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物相對(duì)減少,但此時(shí)細(xì)胞趨于凋亡,活細(xì)胞的 NAD(P)H依賴型氧化還原脫氫酶活性較弱(圖8),呼吸代謝活動(dòng)較為不旺盛,無(wú)法分解利用光合作用產(chǎn)生的碳水化合物,導(dǎo)致細(xì)胞密度增加,細(xì)胞浮力減小.

其次,溫度對(duì)浮力的調(diào)節(jié)還表現(xiàn)為溫度引起偽空胞含量的改變.偽空胞是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的圓柱體氣囊組成,其主要功能是為細(xì)胞提供浮力并參與浮力調(diào)節(jié),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)偽空胞提供的浮力足夠抵消壓載物的累積時(shí),細(xì)胞將會(huì)上浮,反之則下沉.Justin 等[18]的研究表明,銅綠微囊藻蛋白含量隨著溫度的升高而增大,細(xì)胞內(nèi)蛋白含量變化趨勢(shì)與細(xì)胞內(nèi)偽空胞一致.本文測(cè)試獲得的蛋白質(zhì)含量結(jié)果顯示,隨著溫度升高,銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)蛋白含量逐漸增大,該結(jié)果與Justin等[18]的研究一致,說(shuō)明隨著溫度的升高,銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)偽空胞含量也逐漸增大.

本文通過(guò)percoll密度梯度離心法得到不同溫度下銅綠微囊藻細(xì)胞的密度,利用浮力定律直接計(jì)算出細(xì)胞所受到的浮力大小,再結(jié)合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、糖含量、蛋白含量、光合速率和代謝速率分析得到,溫度主要通過(guò)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速代謝速率、光合速率和偽空胞含量來(lái)改變細(xì)胞密度,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞浮力的調(diào)節(jié). 本文所獲得的結(jié)果正好印證了孔繁祥等[36]將銅綠微囊藻的生長(zhǎng)與水華形成分為休眠、復(fù)蘇、生物量增加(生長(zhǎng))、上浮及聚集等階段的研究結(jié)論;水體中銅綠微囊藻的生命活動(dòng)因?yàn)橐荒晁募镜臏囟炔町惗憩F(xiàn)為顯著不同的生態(tài)階段;由此可見(jiàn),溫度對(duì)細(xì)胞浮力的調(diào)控在銅綠微囊藻生命活動(dòng)的不同階段中起到了重要作用.

4 結(jié)論

4.1 溫度通過(guò)影響銅綠微囊藻細(xì)胞的光合速率、生長(zhǎng)代謝速率和偽空胞含量來(lái)改變細(xì)胞的密度,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞浮力的調(diào)節(jié).

4.2 10～15℃時(shí)銅綠微囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝速率降低,光合作用產(chǎn)生的糖類(lèi)在細(xì)胞累積,導(dǎo)致密度增大,浮力減小,細(xì)胞發(fā)生沉降,低溫下糖含量增加使得細(xì)胞密度增大是浮力消失的主要原因.

4.3 20～30℃時(shí)銅綠微囊藻快速的生長(zhǎng)代謝速率及時(shí)消耗了光合作用產(chǎn)生的碳水化合物,導(dǎo)致細(xì)胞密度減小;同時(shí)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量偽空胞所提供的浮力足以抵消壓載物的累積,最終細(xì)胞上浮.

4.4 細(xì)胞漂浮沉降的溫度閾值在15～20℃間.

[1] Granf G G, Diurnal mixing and the vertical distribution of phytoplankton in a shallow equatorial lake [J]. Ecol., 1974,62: 611-629.

[2] Robarts R D and Zohary T, Microcystis aeruginosa and underwater light attenuation in a hypertrophic lake [J]. Ecol., 1984,72:1001-1007.

[3] Dokulil M T, Teubner K. Cyanobaeterial dominance in lakes [J]. Hydrobiologin, 2000,438:1-12.

[4] Irene K E, Bnmberg A K．The importance of shallow sediments in the recruitment of Anabaena and Aphanizomenon (Cyanophyeeae) [J]. Phycol., 2004,40:831-836.

[5] Humphries S E, Lyne V D. Cyanopbyte blooms the role of cellbuoyancy [J]. Limnol. Oeeanngr., 1988,33:79-91.

[6] Walsby A E, Hayes P K, Roje R, et al. The selective advantage of buoyancy provided by gas vesicles for planktonic cyanobacteria in the Baltic Sea [J]. New Phytol., 1997,136:407-417.

[7] Klemer A R, Feuillade J, Feuiilade M. Cyanobaeterial blooms: carbon and nitrogen limitation have opposite effects on the buoyancy of Oscillatorial [J]. Science, 1982,215:1629-1631.

[8] Gad G G, Oliver R L. Vertical separation of light and available nutrients as a factor causing replacement of green algae by blue-green algae in the plankton of a stratified lake [J]. Ecol., 1982,70:829-844.

[9] Chu Z S, Jin x C, Yang B ,et al．Buoyancy regulation of Microcystisflos-aquae during phosphorus-limited and nitrogenlimited growth [J]. Journal of Plankton Research, 2007,29:739-745.

[10] Brunberg A K, Blomqvist P. Benthic overwintering of Microcystic colonies of under different environmental conditions [J]. Journal of lankton Research, 2002,24:1247-1252.

[11] Irene K E, Brunberg A K. The importance of shallow sediments inthe recruitment of Anabaena and aphanizomenon (Cyanophyceae) [J]. Journal of Phycology, 2004,40:831-836.

[12] 金相燦,儲(chǔ)昭升,楊 波,等.溫度對(duì)水華微囊藻及孟氏浮游藍(lán)絲藻生長(zhǎng)、光合作用及浮力變化的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008,28(1):50-55.

[13] Walsby A E, Gas vesicles [J]. Microbiol. Rev., 1994,58:94-144.

[14] Thomas R H, Walsby A E. Buoyancy regulation in a strain of Microcystis [J]. Journal of General Microbiology, 1985,131:799-809.

[15] Kinsman R, Ibelings B W, Walsby A E. Gas vesicle collapsemby turgor pressure and its role in buoyancy regulation by Anabaena flos-aquae [J]. Gen. Microbiol., 1991,137:1171-1178.

[16] Bormans M, Sherman B S, Webster I T. Is buoyancy regulationin cyanobacteria anadaptation to exploit separation of light andnutrients [J]. Mar Freshw. Res., 1999,50(8):897-9061.

[17] 梁 瑜,陳雪初,孔海南,等.遮光圍隔中銅綠微囊藻的時(shí)空分布特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2007,27(6):821-825.

[18] Justin B ,George G. Variations in the buoyancy response of Microcystis aeruginosa to nitrogen,phosphorus and light [J]. Journal of lankton Research, 2001,23:1399-1411.

[19] Thomas R H, Walsby A E. The Effect of Temperature on Recovery of Buoyancy by Microcystis [J]. Journal of General Microbiolog, 1986,132:1665-1672.

[20] Maxwell K, Johnson G N. Chlorophyll fluorescence-a practicalguide [J]. Exp Bot, 2000,51(345):659-6681.

[21] Guillard R R, Kilham P, Jackson T A. Kineticsofsilicon-limited growth inmarinediatomthalassiosira-pseudonana hassle andheimdal = cyclotella-nana hustedt [J]. Journal of Phycology, 1973,9:233-237.

[22] Berridge M V, Herst P M, Tan A S. Tetrazolium dyes as tools incell biology: New in sights in to their cellular reducion [J]. Biotechnol. Annu. Rev., 2005,11:127-1521.

[23] Jieli lirongsong. Applicability of the M T T assay for measuring viability of cyanobacteria and algae, specifically for Microcystis aeruginosa (Chroococcales, Cyanobacteria) [J]. Phycologia, 2007, 46(5):593-599.

[24] 李 杰,丁 濤,鄭凌凌.滇池微囊藻沉降細(xì)胞生理特性及沉降比例動(dòng)態(tài)變化研究 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2010,31(3):668-672.

[25] 章宗涉,黃祥飛.淡水浮游生物研究方法 [M]. 北京科學(xué)出版社, 1991.

[26] 張 程,袁宏志.溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程中乙醇脫氫酶的活性效應(yīng).山西科技 [J], 2008,4:100-104.

[27] 袁麗娜,宋 煒,肖 琳,等.多環(huán)境因素全面正交作用對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的效應(yīng)研究 [J]. 南京大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,44(4):408-414.

[28] 李闊宇,宋立榮,萬(wàn) 能.底泥中微囊藻復(fù)蘇和生長(zhǎng)特征的研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2004,28(2):113-118.

[29] Hua J B, Zong Z X. Experimental research on formation of algae bloom in Yanghereservoir [J]. Universitatis Pekinensis (Acta Scientiarum Naturalium), 1994,30:476-484.

[30] 劉玉生,韓 梅,梁占斌.光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)滇池微囊藻生長(zhǎng)的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 1995,8(6):7-11.

[31] Kromkamp J, Mur L R. Buoyant density changes in thecyanobacterium Microcystis aeruginosa due to changes in the cellular carbohydrate content [J]. FEMS Microbiol. Lett., 1984, 25:105-109.

[32] Wallace B B, Hamilton D P. The effect of variations inirradiance on buoyancy regulation in Microcystis aeruginosa [J]. Limnol. Oceanogr., 1999,44:273-281.

[33] Wallace B B, Hamilton D P. Simulation of water-bloom formation in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa [J]. PlanktonRes., 2000,22:1127-1138.

[34] Kromkamp J C, Walsby A E. A computer model of buoyancy and vertical migration in cyanobacteria [J]. Journal of Plankton Research, 1990,12:161-183.

[35] Nicola D’Ambrosio, Carmen Arena. Temperature response of photosynthesis,excitation energy dissipation and alternative electron sinks to carbon assimilation in Beta vulgaris L [J]. Environmental and Experimental Botany, 2006,55:248-257.

[36] 孔繁翔,高 光.大型淺水富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻水華形成機(jī)理的思考 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2005,25(3):589-595.

Effects of temperature on the buoyancy of Microcystis aeruginosa.

ZHOU Bei1,2, BI Yong-hong1*, HU Zheng-yu1

(1.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2014,34(7)：1847～1854

Microcystis aeruginosa were cultured in different temperature: 10 ℃, 15 ℃, 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃ to screen the effects of temperature on buoyancy regulation. Cell density was measured by percoll density gradient centrifugation and cell buoyancy was calculated by the buoyancy formula. Simultaneously, biomass, specific growth rate, the photosynthetic activity, the activity of NAD (P) H dependent oxidoreductase, intracellular carbohydrate, protein content, the percentage of floating cells were measured. With the increasing of the experimental temperature (10℃-30℃), buoyancy, the percentage of floating cells, intracellular protein content, photosynthesis rate and the activity of NAD (P) H dependent oxidoreductase increased and the intracellular carbohydrate content decreased. After 7days cultured at 10, 15℃, cell density were increased by 2.7% and 1.3%, respectively; carbohydrate content were increased by 95.3% and 65.5%, respectively; the percentage of floating cells were reduced by 23.8% and 18.3, respectively; the activity of NAD (P) H dependent oxidoreductase were reduced by 23.8 % and 18.3% respectively. After 7days cultured at 20, 25, 30 ℃, cell density were reduced by 2.8%, 3.8% and 3.2%, respectively; carbohydrate content were reduced by 8.5%, 2.9% and 19.4%, respectively; the percentage of floating cells were increased by 0%, 7% and 8.5%, respectively; the activity of NAD (P)H dependent oxidoreductase were increased by 0%, 7% and 8.5%, respectively. It was concluded that cell growth rate, photosynthetic rate, metabolic rate were the function of temperature in the buoyancy regulation of Microcystis aeruginosa. The main reason for the buoyancy loss is the accumulation of carbohydrate, the temperature threshold value for the buoyancy is between 15～20℃.

temperature；buoyancy；the regulation mechanism；Microcystis aeruginosa

X171

A

100-6923(2014)07-1847-08

周 貝(1987-),女,河南新鄉(xiāng)人,中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所博士研究生,主要研究方向?yàn)樗蛏鷳B(tài)學(xué).

2013-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31123001);國(guó)家973項(xiàng)目(2008CB418002)

* 責(zé)任作者, 副研究員, biyh@ihb.ac.cn