補(bǔ)充山菠菜多糖對(duì)長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠肝SMAD4、鐵調(diào)素和腎促紅細(xì)胞生成素表達(dá)的影響

王金霞 劉玉倩 常麗新 王羽

1河北師范大學(xué)體育學(xué)院（石家莊 050024）2河北理工大學(xué)化工與生物技術(shù)學(xué)院

機(jī)體鐵貯備不足直接影響運(yùn)動(dòng)機(jī)體的O2運(yùn)輸和能量代謝，誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)耐力下降［1］。由于運(yùn)動(dòng)常伴有紅血球溶解、血尿、出汗、胃腸道出血等現(xiàn)象，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)極易誘發(fā)運(yùn)動(dòng)員（尤其是女運(yùn)動(dòng)員）機(jī)體鐵缺乏癥（iron deficiency，ID）［2-4］。有報(bào)道，從事不同運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的女運(yùn)動(dòng)員ID的發(fā)病率為25%～36%，賽季期間發(fā)病率高達(dá)70%［5，6］。 鐵缺乏癥如得不到有效治療，會(huì)導(dǎo)致缺鐵性貧血（iron deficiency anaemia，IDA）［7］。鐵調(diào)素（hepcidin）是一種富含半胱氨酸的肝臟抗菌多肽，對(duì)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵性的負(fù)調(diào)控作用［8］。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）-SMADs是介導(dǎo)hepcidin表達(dá)的主要信號(hào)通路，SMAD4是通路中關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)因子，可影響hepcidin轉(zhuǎn)錄［9，10］。 山菠菜提取物——山菠菜多糖（Atriplex hortensis polysaccharide，AHP）具有補(bǔ)血止血的功效，對(duì)ID有較好的輔助治療效果，但其治療機(jī)制尚不明了。本研究采用長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠模型，觀察補(bǔ)充山菠菜多糖能否作為hepcidin抑制劑對(duì)大鼠肝SMAD4起調(diào)控作用，從而改善運(yùn)動(dòng)鐵缺乏癥大鼠的機(jī)體鐵狀態(tài)，進(jìn)一步探討山菠菜多糖改善運(yùn)動(dòng)鐵缺乏癥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及運(yùn)動(dòng)方案

4周齡雄性Wistar大鼠24只，體重（130±10）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2008-1-003。所有動(dòng)物均無訓(xùn)練史。每日自然光照射，自由進(jìn)食飲水，室溫22～25℃，濕度50%±5%，分籠喂養(yǎng)。隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（control group，CG組）、運(yùn)動(dòng)組（exercise group，EG組）和運(yùn)動(dòng)+多糖組（exercise+polysaccharide，EP組）。EG組和EP組大鼠進(jìn)行5周跑臺(tái)訓(xùn)練，速度25 m/min，坡度為0。每周訓(xùn)練6天，周日休息。前2周為運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)階段，每天訓(xùn)練1次，后3周每天訓(xùn)練2次，實(shí)驗(yàn)第1天大鼠訓(xùn)練1 min，以后以每次2 min的速度遞增，最后一天訓(xùn)練95 min。

1.2 藥品配備及動(dòng)物給藥

將清洗干凈的山菠菜葉子烘干后粉碎，索氏提取器脫脂4～6 h，60℃烘干備用。稱取脫脂后的山菠菜于錐形瓶中，以液料比為28∶1（ml/g）加入pH為4.6的蒸餾水，低火微波提取4.5 min，過濾，大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附解析濾液，可分離純化粗多糖溶液，濃縮，醇沉，過濾，烘干沉淀，得粗多糖。以上提純工作由河北理工大學(xué)化工與生物技術(shù)學(xué)院協(xié)助完成。將山菠菜提取物置于-20℃冰箱保存，提取物多糖含量約為43%。使用前按照100 mg/kg的劑量將提取物配成懸濁液。為防止藥品過期沉淀，每天配置1次。于實(shí)驗(yàn)第3周開始對(duì)EP組大鼠每天下午6：00灌胃1次，每次2 ml，CG組和EG組給予同等劑量的生理鹽水。

1.3 取材

于5周末運(yùn)動(dòng)后24 h取材。所有大鼠均采用1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，打開胸腔，心尖取血。將血液放入加有促凝劑的促凝管中離心以備血清鐵測(cè)定。用DEPC配置的生理鹽水于大鼠升主動(dòng)脈迅速灌流，迅速剪取大鼠腎臟和肝臟，裝入EP管，投入液氮以備促紅細(xì)胞生成素 （erthopoietin，EPO）、SMAD4和hepcidin mRNA蛋白測(cè)定。

1.4 采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎臟EPO、肝臟SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)

1.4.1 cDNA合成

取肝臟、腎臟樣品組織各約100 mg，加入1 ml Trizol Reagent（Invitrogen，USA），在玻璃勻漿器中進(jìn)行冰上勻漿，在磨碎組織中加入200 μl氯仿，震蕩離心后提取上清液，加入異丙醇析出RNA沉淀，用75%的乙醇溶劑清洗兩遍沉淀后的RNA，晾干后加入滅活的DEPC水測(cè)定RNA濃度。將提取的RNA放入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，放入PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 （70℃ 10 min，42℃ 1 h、75℃ 15 min），合成cDNA。引物序列參照Thorsten Bramey等的研究［11，12］設(shè)計(jì)，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.2 cDNA擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在冰上配制PCR反應(yīng)液，PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 95℃ 4 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃1 min（34個(gè)循環(huán)）。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Fujifilm Las-4000）分析與β-actin吸光值的比值。

1.5 大鼠血清鐵狀態(tài)的測(cè)定

血清鐵 （Serum iron，SI）、 血清未飽和結(jié)合鐵（serum unsaturated iron binding capacity，UIBC）和血清總鐵結(jié)合力 （serum total iron binding capacity，TIBC）試劑盒由南京建成生物科技公司提供，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)全部采用SPSS18.0進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），所得結(jié)果用表示，顯著性水平為P<0.05，非常顯著性水平為P<0.01。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠EPO、SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟EPO、肝SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)

圖1顯示，運(yùn)動(dòng)組EPO表達(dá)（0.93±0.20）顯著低于對(duì)照組（1.41±0.35）（P<0.05），肝SMAD4 mRNA（0.94±0.01）和hepcidin mRNA表達(dá)（1.04±0.04）顯著高于對(duì)照組（SMAD4：0.75±0.10，hepcidin：0.80±0.10）（P<0.01）。 運(yùn)動(dòng)+多糖組EPO表達(dá)（2.35±0.50）顯著高于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組 （P<0.01），肝SMAD4 mRNA（0.65±0.10）和hepcidin mRNA表達(dá)（0.66±0.12）顯著低于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組（P<0.05，P<0.01）。

2.2 大鼠血清鐵狀態(tài)

表2顯示，運(yùn)動(dòng)組大鼠血清鐵、未飽和鐵結(jié)合力和血清總鐵結(jié)合力顯著低于對(duì)照組 （P<0.01）；運(yùn)動(dòng)+多糖組大鼠血清鐵、未飽和結(jié)合鐵和血清總鐵結(jié)合力顯著低于對(duì)照組（P<0.05）而顯著高于運(yùn)動(dòng)組（P<0.05）。

表2 各組大鼠血清鐵狀態(tài)比較

3 討論

3.1 補(bǔ)充山菠菜多糖對(duì)長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)的影響

鐵調(diào)素（hepcidin）是機(jī)體鐵狀態(tài)的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，SMAD4是介導(dǎo)hepcidin調(diào)控通路中的關(guān)鍵上游信號(hào)因子。1995年Sekelsky等在黑腹果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)sma（mothers against dpp）的同源蛋白mad參與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transfor growth beta，TGF-β）的信號(hào)傳導(dǎo)，后陸續(xù)在爪蟾等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)sma，之后mad和sma被統(tǒng)一命名為Smad蛋白家族［13］。 Smad1-9負(fù)責(zé)將TGF-β/Smads信號(hào)從細(xì)胞膜傳導(dǎo)至細(xì)胞核并參與TGF-β靶基因的調(diào)節(jié)。SMAD4是Smads蛋白家族的關(guān)鍵蛋白，由552個(gè)氨基酸殘基編碼而成，含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。SMAD4與其他Smad不同，擁有獨(dú)立的SMAD4活性區(qū)，幾乎可以與所有活化受體調(diào)節(jié)型smads蛋白結(jié)合，形成低聚體復(fù)合物并參與信號(hào)傳導(dǎo)［14］。有研究證實(shí)，小鼠敲除肝臟SMAD4基因后，hepcidin表達(dá)降低，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝鐵沉積［15］；骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphgenetic proteins，BMPS）屬于TGF-β超家族成員［16］。研究證實(shí)，BMP-SMADs是調(diào)控肝臟hepcidin表達(dá)的主要信號(hào)通路，BMP2、BMP4、BMP6和BMP9均被證實(shí)能調(diào)控hepcidin轉(zhuǎn)錄［17-20］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，BMP6 mRNA表達(dá)增加BMP6上調(diào)hepcidin表達(dá)，機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)遭到破壞［21］。 BMP6對(duì)BMP-SMADs通路信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)起著關(guān)鍵性作用，BMP6與BMP II型受體BMPR-II先行結(jié)合，誘導(dǎo)BMP I型受體BMPR-I磷酸化，并與其形成復(fù)合物，這些復(fù)合物轉(zhuǎn)而促使SMADs（Smads1/5/8）進(jìn)一步磷酸化，受體調(diào)節(jié)的SMADs（Smad1/5/8）與SMAD4形成異源復(fù)合物轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，影響hepcidin轉(zhuǎn)錄［22］。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，BMP6 mRNA表達(dá)同時(shí)受鐵的調(diào)控，鐵能夠誘導(dǎo)BMP6 mRNA表達(dá)和smad5磷酸化［23-25］。Hepcidin主要通過抑制小腸鐵吸收、巨噬細(xì)胞鐵釋放和肝鐵動(dòng)員負(fù)調(diào)控機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。當(dāng)前，hepcidin已成為衡量運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)后尿液鐵狀態(tài)和血清鐵狀態(tài)的敏感生物指標(biāo)之一［26，27］。

本實(shí)驗(yàn)中，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，大鼠SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增加，機(jī)體鐵狀態(tài)明顯下降；補(bǔ)充多糖后，運(yùn)動(dòng)+多糖組SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)量與運(yùn)動(dòng)組相比顯著下降，機(jī)體鐵狀態(tài)明顯升高。結(jié)果表明長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過程中，hepcidin表達(dá)上調(diào)，機(jī)體鐵輸出量增加，誘發(fā)機(jī)體鐵缺乏；補(bǔ)充山菠菜多糖能夠抑制SMAD4表達(dá)，從而下調(diào)hepcidin水平，改善機(jī)體缺鐵狀態(tài)。

3.2 補(bǔ)充山菠菜多糖對(duì)長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠EPO表達(dá)的影響

EPO是主要由腎臟分泌的激素樣物質(zhì)，后發(fā)現(xiàn)肝臟也可分泌。EPO可上調(diào)骨髓幼紅細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR1）表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞攝鐵能力，促進(jìn)紅細(xì)胞中Hb合成，降低血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，被廣泛應(yīng)用于貧血的臨床治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠腎臟EPO表達(dá)、血清鐵含量較對(duì)照組顯著降低，hepcidin表達(dá)量顯著增加；補(bǔ)充山菠菜多糖后大鼠腎臟EPO表達(dá)量、血清鐵含量與對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組比較顯著增加，hepcidin表達(dá)量顯著降低。這表明長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)抑制EPO表達(dá)，使紅細(xì)胞生成量減少，機(jī)體運(yùn)氧能力降低；補(bǔ)充山菠菜多糖后，大鼠腎臟EPO表達(dá)量增加，hepcidin表達(dá)受到抑制，機(jī)體鐵水平升高，機(jī)體鐵缺乏得以改善。

3.3 長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中大鼠機(jī)體hepcidin和鐵狀態(tài)的變化

Hepcidin作為維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的核心分子，主要通過抑制小腸鐵吸收、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)鐵釋放和肝鐵動(dòng)員負(fù)調(diào)控機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。Hepcidin與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（ferroportin-1，F(xiàn)PN-1）相互作用，引起FPN-1內(nèi)化和降解，降低細(xì)胞向外釋放鐵的能力，進(jìn)而影響機(jī)體鐵代謝。本研究結(jié)果顯示，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠機(jī)體hepcidin表達(dá)量與對(duì)照組比較顯著升高，機(jī)體鐵狀態(tài)顯著下降。Hepcidin水平升高誘發(fā)機(jī)體鐵缺乏，低表達(dá)則會(huì)造成鐵過載，引發(fā)遺傳性血色素沉著等多種慢性疾病［28］。本研究結(jié)果表明，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起hepcidin高表達(dá)，高水平hepcidin會(huì)降低網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞向血清中釋放鐵的能力，同時(shí)小腸鐵吸收及機(jī)體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體鐵水平下降，進(jìn)而引起機(jī)體鐵缺乏，影響機(jī)體鐵代謝。補(bǔ)充多糖后，肝臟hepcidin合成量降低，F(xiàn)PN-1重新在小腸上皮細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，巨噬細(xì)胞向血清中釋放鐵的能力及小腸細(xì)胞的攝鐵能力均得以增強(qiáng)，血清中鐵含量增加，保證了機(jī)體鐵的正常需求。

4 總結(jié)

補(bǔ)充山菠菜多糖能刺激長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟EPO分泌，抑制大鼠肝臟SMAD4和hepcidin mRNA表達(dá)，改善長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠機(jī)體鐵缺乏癥。但其中EPO通過何途徑影響SMAD4表達(dá)仍需研究。

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