節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及比對

趙 芹,謝大森,江 彪,羅少波,彭慶務(wù),李明珠

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,廣東廣州510640)

節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及比對

趙 芹①,②,謝大森①,江 彪,羅少波,彭慶務(wù),李明珠

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,廣東廣州510640)

對8個節(jié)瓜(Benincasa hispida var.chieh-qua How)品系基因組DNA中的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列進行擴增,并對品系A(chǔ)39FA的29個克隆產(chǎn)物的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列的系統(tǒng)進化和同源性進行了分析,還對29條氨基酸序列進行了比對。擴增結(jié)果表明:8個節(jié)瓜品系的基因組DNA中均包含長度約260 bp的逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸片段;從品系A(chǔ)39FA中獲得的29條Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列(CqRt1至CqRt29)的長度為247～267 bp,同源率為46.2%～98.1%,而它們的氨基酸序列同源率為26.7%～98.8%。序列分析結(jié)果表明:節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列中堿基A、T、G和C的數(shù)量分別為65～96、47～92、45～74和32～49,所有序列均富含堿基A和T,AT/GC比為1.35～2.33;缺失突變是造成節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度差異的主要因素,在序列長度和堿基組成方面的明顯差異表明節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列具有高度異質(zhì)性。翻譯后的氨基酸序列中有21條序列存在終止密碼子突變、12條序列存在移框突變,表明Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子是節(jié)瓜基因組內(nèi)序列重組的熱點。通過聚類分析可將29個逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列分為5個家族(Family),分別包括16、4、4、4和1條序列,其中Family 1可能是具有轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子家族,但存在轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)錄酶序列僅占全部序列數(shù)量的20.69%。將每一家族中的1～2條序列與其他15種植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列進行比對,顯示出較高的同源性。研究結(jié)果表明:節(jié)瓜與其他植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子可能有相同起源,而且Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子可在不同類群間橫向傳遞。

節(jié)瓜;Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子;逆轉(zhuǎn)錄酶;序列分析;同源性;系統(tǒng)發(fā)育

逆轉(zhuǎn)座子是以RNA為中間產(chǎn)物,在寄主基因組內(nèi)不斷轉(zhuǎn)座增殖并影響寄主基因組大小、結(jié)構(gòu)、功能及進化等的轉(zhuǎn)座元件,是真核生物中種類最多、分布最廣的轉(zhuǎn)座因子,還是植物核基因組的重要組成部分,通常約占核基因組大小的一半以上[1]。根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)特征,逆轉(zhuǎn)座子可分為長末端重復序列(long terminal repeat,LTR)和非長末端重復序列(non-long terminal repeat,non-LTR)兩類,前者又可分為Ty1-copia類和Ty3-gypsy類,其中Ty1-copia類在植物界中廣泛分布,且相關(guān)研究最多[2]。

在受到各種生物和非生物因子的脅迫后,植物體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)座子活性被激活,引起基因突變、基因組擴增及重排等,導致植物發(fā)生遺傳變異,因此,開展逆轉(zhuǎn)座子的相關(guān)研究對研究植物基因組的組成、進化及基因的表達調(diào)控有重要意義。依據(jù)進化關(guān)系可將逆轉(zhuǎn)座子劃分為不同家族,各家族內(nèi)成員越復雜,存在具轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子的可能性越大、親緣關(guān)系越近,轉(zhuǎn)座發(fā)生的時間也可能越近;反之,則轉(zhuǎn)座歷時久遠,繼續(xù)轉(zhuǎn)座的可能性也越小[3]。目前,對許多作物的逆轉(zhuǎn)座子組成與分析已有研究報道[4-6],且逆轉(zhuǎn)座子已廣泛應用于植物種質(zhì)資源及遺傳育種研究,如應用于鈍稃野大麥(Hordeum spontaneum C.Koch.)[7]、豌豆屬(Pisum Linn.)種類[8]、野豌豆屬(Vicia Linn.)種類[9]、煙草(NicotianatabacumLinn.)[10]、茄子(Solanum melongena Linn.)[11]、柑橘屬(Citrus Linn.)和枳屬(Poncirus Raf.)種類[12-14]、蘋果(Malus pumila Mill.)[15-17]和柿(Diospyros kaki Thunb.)[18-19]等類群的種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)進化等方面的研究。

節(jié)瓜(Benincasa hispida var.chieh-qua How)是華南地區(qū)特色蔬菜,品種十分豐富。作者所在研究室曾通過鐮刀菌酸離體篩選獲得節(jié)瓜抗枯萎病突變體,并通過航天誘變育種獲得一系列有價值的育種材料,但目前對節(jié)瓜不同品種的形成與進化關(guān)系不甚明了,對節(jié)瓜各種生物學性狀的遺傳多樣性研究報道也甚少。因此,明確節(jié)瓜遺傳進化及生物學性狀與逆轉(zhuǎn)座子之間的關(guān)系,對追溯現(xiàn)有節(jié)瓜品種來源和培育優(yōu)良節(jié)瓜品種具有重要意義。在前期采用抑制消減技術(shù)研究感病節(jié)瓜及其抗病突變體與枯萎病菌互作機制時,作者所在研究室分離獲得了與Ty1-copia多聚蛋白相似性很高的基因片段,推測在接種枯萎病菌后節(jié)瓜逆轉(zhuǎn)座子可能被激活[20]。為此,作者對節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列進行克隆和分析,并研究其轉(zhuǎn)錄活性,探討節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶片段的變化特點及其與其他植物的相似性,以期為節(jié)瓜基因組起源與進化及遺傳多樣性評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試節(jié)瓜品系612FA、H2251、SY3、LT550、A06、A39FA、P3-1-2和LT8的種子由研究室多代自交保存;將其播種于滅菌基質(zhì)上,在溫度25℃、光照度2 000 lx、光照時間12 h·d-1的人工氣候箱中培養(yǎng)至幼苗長出2片真葉。

大腸桿菌菌株DH5α由本課題組保存;瓊脂糖購自廣州威佳生物技術(shù)有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs和pMD18-T載體試劑盒購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司;DNA回收試劑盒、CTAB、Amp抗生素和DNA marker購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及逆轉(zhuǎn)錄酶片段的PCR擴增 采集新鮮葉片,利用CTAB法提取基因組總DNA,將其溶解于少量滅菌雙蒸水中。采用質(zhì)量體積分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳和GENEQUANT納米紫外分光光度計(德國Eppendorf公司)檢測總DNA的濃度和純度,于-20℃保存、備用。

參照文獻[21]設(shè)計擴增逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的上、下游引物,上游引物Ty1-F的序列為5′-ACNG CNTTRRTNCARGG-3′,下游引物Ty1-R的序列為5′-AYCATYTCYTCNACYTA-3′(N=A/T/C/G、R=A/ G、Y=T/C)。PCR反應體系總體積25 μL,包括50 ng DNA,0.16 mmol·L-1dNTPs,2.5 μL 10×Ex buffer(含MgCl2),1.0 μmol·L-1上、下游引物和1 U Ex Taq DNA聚合酶,用滅菌雙蒸水補足體積。PCR反應在GeneAmp PCR System 9700 PCR儀(美國ABI公司)上完成,PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s、45℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分數(shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,并用GeneGeniusBio Imaging System(美國Bio-Rad公司)進行觀察和拍照。

商業(yè)人像攝影自從90年代初盛行全國以來，在攝影風格上大致經(jīng)歷了三個階段。最初是國營照相館的中規(guī)中矩的固定模式，人物造型比較古樸，不注重化妝造型，雖然講究用光技法，但照片沒有時代感，缺乏新意。而后，隨著臺灣影樓的大舉進入，其平光重妝，講究人物包裝與造型多變的攝影風格成為全國影樓效仿的樣板。90年代末，“前衛(wèi)”、“時尚”攝影又成為潮流。迎合時尚是名利雙收的一條捷徑。創(chuàng)意攝影運用特殊手段以夸張的色彩、反常規(guī)構(gòu)圖、兩底疊放等表現(xiàn)形式和手法，構(gòu)筑作品的情調(diào)，刻畫被攝者的性格和心態(tài)。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收純化與克隆分析 純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體在16℃條件下過夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,并用Amp抗生素和半乳糖苷酶的底物X-gal進行藍白斑篩選;挑取白斑菌落,采用M13通用引物進行PCR擴增;取1 mL陽性克隆菌液交由廣州英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的測定及序列分析 利用NCBI VecScreen程序去除載體部分,用DNAStar軟件對獲得的逆轉(zhuǎn)錄酶序列長度、堿基組成和AT/GC比等進行分析與序列同源比對,結(jié)合GenBank中其他植物的相應序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的PCR擴增結(jié)果

利用設(shè)計的簡并引物擴增Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列,結(jié)果顯示:從8個節(jié)瓜品系中均擴增得到長度約260 bp的逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列片段(圖1),與Tao等[22]對枳〔Poncirus trifoliata(Linn.) Raf.〕Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的研究結(jié)果一致,說明Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子在節(jié)瓜中普遍存在。

圖1 8個節(jié)瓜品系Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的PCR擴增圖譜Fig.1 PCR amplification pattern of sequence of reverse transcriptase gene of Ty1-copia-like retrotransposon from 8 lines of Benincasa hispida var.chieh-qua How

將品系A(chǔ)39FA的PCR擴增產(chǎn)物回收、克隆,隨機挑取30個菌落,對PCR鑒定陽性的克隆測序,獲得29條核苷酸序列片段。利用NCBI BLAST程序進行同源搜索,結(jié)果顯示:獲得的所有片段均含有逆轉(zhuǎn)錄酶保守域,與其他植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列具有較高同源性,說明從節(jié)瓜中獲得的這些核苷酸序列片段均為Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列,依次命名為CqRt1至CqRt29。

2.2 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列組成分析

節(jié)瓜品系A(chǔ)39FA的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的組成見表1。29個Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度并不完全一致,變化范圍為247～267 bp,其中CqRt24序列最長,CqRt7序列最短,多數(shù)序列長度為266 bp。Stergiou等[23]報道油橄欖(Olea europaea Linn.)的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度為273 bp,對應編碼91個氨基酸;而本研究獲得的29個逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度均小于273 bp,均有不同程度的缺失,說明缺失突變是造成節(jié)瓜逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度變化的主要原因。對堿基組成的分析結(jié)果顯示:節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列中堿基A、T、G和C的數(shù)量分別為65～96、47～92、45～74和32～49,所有序列均富含堿基A和T,AT/GC比為1.35～2.33,與油橄欖的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的堿基組成一致[23]。

由此可見,由同一簡并引物PCR擴增所得的節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列并不一致,它們的堿基組成及序列長度均存在較大差異,表明節(jié)瓜品系內(nèi)同一類群逆轉(zhuǎn)座子間存在高度的異質(zhì)性,蘋果、黃瓜(Cucumis sativus Linn.)、辣椒(Capsicum annuum Linn.)和梨(Pyrus spp.)等植物也有類似特點[24-27]。

2.3 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的系統(tǒng)進化分析

為闡明節(jié)瓜中Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子間的相互關(guān)系,利用DNAStar中的MegAlign軟件對29條逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列進行聚類分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果見圖2。根據(jù)核苷酸替代值可將29條序列分成5個家族(Family),同一家族內(nèi)的序列代表來源于同一祖先的遺傳家系,而不同家族包含的序列數(shù)差異則反映了各家族逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程的差異,包含克隆數(shù)越多的家族歷史越久遠。Family 5僅有1條序列,與其他家族的遺傳距離較遠;Family 1至Family 4分別包括16、4、4和4條序列,其中Family 1包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的55.17%,說明該家族是構(gòu)成節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的主要成分。

表1 節(jié)瓜品系A(chǔ)39FA的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的長度和堿基組成Table1 Length and base composition of nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from line A39FA of Benincasa hispida var.chieh-qua How

2.4 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分析

節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分析結(jié)果見表2。

結(jié)合圖2和表2、根據(jù)核苷酸替代值綜合分析可見:在29條節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列中CqRt6和CqRt12的遺傳距離最近,其核苷酸序列和氨基酸序列的同源率均最高,分別達98.1%和98.8%;CqRt15與CqRt27的核苷酸序列同源率最低(46.2%),CqRt16與CqRt28的氨基酸序列同源率最低(26.7%),說明同一來源的逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性較高。Family 1中CqRt9與CqRt11核苷酸序列遺傳距離最近,其同源率為92.8%,氨基酸序列同源率為84.2%;Family 2中CqRt7與CqRt15核苷酸序列遺傳距離最近,其同源率為91.5%,氨基酸序列同源率為84.1%;Family 3中CqRt20與CqRt29核苷酸序列遺傳距離最近,其同源率為93.6%,氨基酸序列同源率為87.5%;Family 4中CqRt6與CqRt12核苷酸序列遺傳距離最近。各家族所包含的克隆數(shù)越多、序列同源率越高,發(fā)生轉(zhuǎn)座的時間越近,具有轉(zhuǎn)座活性的可能性也越大。Family 1包含4個具有轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)座子(CqRt14、CqRt18、CqRt21和CqRt24),可能是具有轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子家族。

圖2 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from Benincasa hispida var.chieh-qua How

表2 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列與氨基酸序列的同源率1)Table2 Homologous rate among nucleotide sequences and among amino acid sequences of reverse trancriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from Benincasa hispida var.chieh-qua How1)

續(xù)表2 Table 2(Continued)

2.5 節(jié)瓜中Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的突變分析

圖3 節(jié)瓜29條Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的比對Fig.3 Alignment of 29 amino acid sequences of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from Benincasa hispida var.chieh-qua How

參照已報道的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸保守序列,將29條節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,結(jié)果見圖3。在29條序列中,有12條氨基酸序列發(fā)生移框突變,分別是CqRt2(第17位氨基酸)、CqRt4(第36位氨基酸)、CqRt6(第14位氨基酸)、CqRt7(第17位氨基酸)、CqRt11(第17位氨基酸)、CqRt12(第14位氨基酸)、CqRt13(第23和第74位氨基酸)、CqRt15(第 44位氨基酸)、CqRt16(第18位氨基酸)、CqRt23(第66位氨基酸)、CqRt24(第39位氨基酸)和CqRt27 (第39位氨基酸)。21個逆轉(zhuǎn)錄酶序列存在終止密碼子突變,其中CqRt15分別在第16、第23、第38和第41位氨基酸處存在4個終止密碼子突變,CqRt4(第45、第56和第69位氨基酸)和CqRt19(第6、第56和第73位氨基酸)存在3個終止密碼子突變,CqRt1(第57和第70位氨基酸)、CqRt2(第9和第41位氨基酸)、CqRt8(第41和第63位氨基酸)、CqRt16(第41和第55位氨基酸)、CqRt22(第22和第37位氨基酸)、CqRt28(第19和第41位氨基酸)和CqRt25(第41和第46氨基酸)存在2個密碼子突變,CqRt3(第49位氨基酸)、CqRt5(第25位氨基酸)、CqRt6(第39位氨基酸)、CqRt9(第70位氨基酸)、CqRt11(第41位氨基酸)、CqRt12(第39位氨基酸)、CqRt13(第45位氨基酸)、CqRt17(第40位氨基酸)、CqRt20(第45位氨基酸)、CqRt23(第49位氨基酸)和CqRt29(第41位氨基酸)存在1個終止密碼子突變。存在轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)錄酶序列為CqRt7、CqRt10、CqRt14、CqRt18、CqRt21和CqRt24,只占全部序列數(shù)量的20.69%,所以導致逆轉(zhuǎn)座子突變、無法表達及逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的重要原因可能為移框突變與終止密碼子突變。

2.6 節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析

將29條節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列進行NCBI BLASTx同源搜索,結(jié)果顯示:來源于節(jié)瓜的29條逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列比較復雜,與黃瓜、水稻(Oryza sativa Linn.)、草莓(Fragaria× ananassa Duch.)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)、葡萄(Vitis vinifera Linn.)、蕓薹(Brassica campestris Linn.)、甜菜(Beta vulgaris Linn.)及藜屬(Chenopodium Linn.)種類的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列有較高同源性。

圖4 節(jié)瓜與其他植物Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from Benincasa hispida var.chieh-qua How and other species

從29條節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的每一個家族選取1～2個序列,結(jié)合GenBank上登錄的部分植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列,利用DNAStar軟件構(gòu)建進化樹,結(jié)果見圖4。結(jié)果表明:供試逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列在聚類圖中分為6組,第1組包括CqRt21氨基酸序列以及甜瓜(Cucumis melo Linn.,CAJ65841)、Cucumis×hytivus J.F.Chen et J.H.Kirkbr.(ADQ85918)、甜橙〔Citrus sinensis(Linn.)Osbeck,CAJ41396〕和茶樹〔Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.,CAJ09747〕的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列;第2組包括Populus ciliate Wall.ex Royle(AAT73703)、梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.,ACZ36925)和歐洲云杉〔Picea abies(Linn.)H.Karst.,CAA11919〕的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列;第3組包括CqRt7氨基酸序列和葡萄(XP_002272586)的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列;第4組包括CqRt20氨基酸序列以及Amaranthus cruentus Linn.(AAG44312)、東方草莓(Fragaria orientalis Lozinsk.,ADP88729)、歐洲油菜(Brassica napus Linn., AAA32987)、Solanum lycopersicum Linn.(AAC34606)、Orobanche hirtiflora(Reut.)Tzvelev(ABD19053)、甜菜(T14589)和水稻(T03662)的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列;第5組包括CqRt14和CqRt10氨基酸序列,且與其他家族遺傳距離較遠; CqRt27氨基酸序列與其他植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的親緣關(guān)系最遠,單獨聚為1個分支,為第6組。

上述分析結(jié)果表明:不同植物種類的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的親緣關(guān)系相近或起源于相同祖先,但有些逆轉(zhuǎn)座子在不同種或?qū)匍g的同源性高于種內(nèi)或?qū)賰?nèi),因此植物基因組中的逆轉(zhuǎn)座子不僅可以在物種世代間縱向傳遞,還可以在不同屬的類群間或同屬的不同種間橫向傳遞。

3 討論和結(jié)論

本研究首次對節(jié)瓜中的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進行PCR擴增,從8條節(jié)瓜品系中均擴增得到260 bp左右的目的片段,說明Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子在節(jié)瓜中廣泛存在。獲得的節(jié)瓜29條逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度變化范圍是247～267 bp,小于枳的逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度(273 bp)[22];且29條Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列長度相差20 bp,小于辣椒[25]和蘋果[24]Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的長度變異,但大于黃瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的長度變異[26];其中21條序列存在1～4個終止密碼子突變, 12條序列存在移碼突變。因此推測節(jié)瓜逆轉(zhuǎn)座子高度異質(zhì)性群體形成的主要原因是缺失突變、移碼突變及終止密碼子突變。逆轉(zhuǎn)座子以自身攜帶的無校對功能的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生RNA中間產(chǎn)物進行增殖,堿基錯配率較高;另外,長期進化過程中,生物體通過各種方式抑制逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座造成致死突變,而逆轉(zhuǎn)座子在脅迫條件下不斷轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)座形成基因組的多樣性與遺傳變異[28-29],兩者的相互作用使節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子這類古老元件在不斷轉(zhuǎn)座與世代傳遞過程中形成了高度異質(zhì)性。

逆轉(zhuǎn)座子廣泛分布于植物基因組中,可在世代間縱向傳遞,也可在物種間橫向傳遞[30-31],部分物種的逆轉(zhuǎn)座子只能在種或?qū)匍g檢測出來,而有些逆轉(zhuǎn)座子則可在多種物種間檢測出來,因此成為研究物種在種或?qū)匍g進化與分化的依據(jù)以及推測其起源及與物種間相互關(guān)系的重要工具[32]。前人研究表明,同一植物類群的逆轉(zhuǎn)座子保守性較強,但序列變異較大,導致種內(nèi)異質(zhì)性差異有時高于種或?qū)匍g的異質(zhì)性差異[24]。本研究中,隨機克隆的29條節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列中,CqRT16序列與CqRT28序列的同源率只有26.7%,而NCBI BLASTx同源搜索結(jié)果表明,節(jié)瓜與黃瓜、甜瓜、草莓、甜菜、水稻、葡萄等植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的相似性較高,其中CqRT21序列與黃瓜(ADQ85918)氨基酸序列的同源率高達90%,這也在一定程度上說明這些物種的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子可能有相同起源,在一定程度上為研究節(jié)瓜的起源提供了依據(jù)。在系統(tǒng)進化樹上,節(jié)瓜29條逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列可分為包含不同序列數(shù)量的5個家族,反映了各家族逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄過程與歷史地位可能存在差異,對節(jié)瓜基因組進化的作用也可能各異。

研究結(jié)果顯示:節(jié)瓜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列在節(jié)瓜不同品系中廣泛存在,可為進一步分離Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子、研究其起源進化和轉(zhuǎn)錄活性特征及開發(fā)鑒評種質(zhì)的分子標記奠定了基礎(chǔ)。

[1] KUMAR A,BENNETZEN J L.Plant retrotransposons[J].Annual Review of Genetics,1999,33:479-532.

[2] FLAVELLA J,SMITH D B,KUMAR A.Extreme heterogeneity of Ty1-copia group retrotransposons in plants[J].Molecular and General Genetics,1992,231:233-242.

[3] TAM S M,MHIRI C,VOGELAAR A,et al.Comparative analyses of genetic diversities within tomato and pepper collections detected by retrotransposon-based SSAP,AFLP and SSR[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,110:819-831.

[4] PEARCE S R,KUMAR A,FLAVELL A J.Activation of the Ty1-copia group retrotransposons of potato(Solatium tuberosum)during protoplast isolation[J].Plant Cell Reports,1996,15:949-953.

[5] ROGERS S A,PAULS K P.Ty1-copia-like retrotransposons of tomato(Lycopersicon esculentum Mill.)[J].Genome,2000,43: 887-894.

[6] ALIX K,RYDER C D,MOORE J,et al.The genomic organization of retrotransposons in Brassica oleracea[J].Plant Molecular Biology,

2005,59:839-851.

[7] KALENDAR R,TANSKANEN J,IMMONEN S,et al.Genome evolution of wild barley(Hordeum spontaneum)by BARE-1 retrotransposondynamicsinresponsetosharpmicroclimatic divergence[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97:6603-6607.

[8] ELLIS T H N,POYSER S J,KNOX M R,et al.Polymorphism of insertion sites of Ty1-copia class retrotransposons and its use for linkage and diversity analysis in pea[J].Molecular and General Genetics,1998,260:9-19.

[9] SANZ A M,GONZALEZ S G,SYED N H,et al.Genetic diversity analysis in Vicia species using retrotransposon-based SSAP markers [J].Molecular Genetics and Genomics,2007,278:433-441.

[10] PETIT M,LIM K Y,JULIO E,et al.Differential impact of retrotransposon populations on the genome of allotetraploid tobacco (Nicotiana tabacum)[J].Molecular Genetics and Genomics, 2007,278:1-15.

[11] 王利英,杜永臣,張 斌,等.茄子IRAP和REMAP分子標記的開發(fā)[J].園藝學報,2008,35(9):1363-1367.

[12] BERNET G P,ASINS M J.Identification and genomic distribution of gypsylikeretrotransposonsinCitrusandPoncirus[J]. Theoretical and Applied Genetics,2003,108:121-130.

[13] BRETóM P,RUIZ C,PINA J A,et al.The diversification of Citrus clementina Hort.ex Tan.,a vegetatively propagated crop species[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2001,21: 285-293.

[14] RUIZ C,ASINS M J.Comparison between Poncirus and Citrus genetic linkage maps[J].Theoretical and Applied Genetics, 2003,106:826-836.

[15] ANTONIUS-KLEMOLA K,KALENDAR R,SCHULMAN A H. TRIM retrotransposons occur in apple and are polymorphic between varieties but not sports[J].Theoretical and Applied Genetics, 2006,112:999-1008.

[16] SUN H Y,DAI H Y,ZHAO G L,et al.Genome-wide characterization of long terminal repeat-retrotransposons in apple reveals the differences in heterogeneity and copy number between Ty1-copia and Ty3-gypsy retrotransposons[J].Journal of Integrative Plant Biology,2008,50:1130-1139.

[17] VENTURI S,DONDINI L,DONINI P,et al.Retrotransposon characterisation and fingerprinting of apple clones by S-SAP markers[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,112:440-444.

[18] DU X Y,ZHANG Q L,LUO Z R.Development of retrotransposon primers and their utilization for germplasm identification in Diospyros spp.(Ebenaceae)[J].Tree Genetics and Genomes,2009,5: 235-245.

[19] GUO D L,ZHANG H Q,LUO Z R.Genetic relationships of Diospyros kaki Thunb.and related species revealed by IRAP and REMAP analysis[J].Plant Science,2006,170:528-533.

[20] 趙 芹,謝大森,羅少波,等.節(jié)瓜與枯萎病菌互作中抑制消減文庫的構(gòu)建及初步分析[J].園藝學報,2013,41(增刊): 2687.

[21] YAO J L,DONGY H,MORRIS B A T.Parthenocarpic apple fruit production conferred by transposon insertion mutations in a MADS-box transcription factor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98:1306-1311.

[22] TAO N G,WEI J,LIU Y Z,et al.Copia-like retrotransposons in a precocious mutant of trifoliate orange〔Poncirus trifoliata(L.) Raf.〕[J].The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 2006,81:1038-1042.

[23] STERGIOU G,KATSIOTIS A,HAGIDIMITRIOU M,et al.Genomic and chromosomal organization of Ty1-copia-like sequences in Olea europaea and evolutionary relationships of Olea retroelements [J].Theoretical and Applied Genetics,2002,104:926-933.

[24] 孫 俊,房經(jīng)貴,高 兵,等.蘋果中Ty1-copia型逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析[J].果樹學報,2005,22(3):193-197.

[25] 刁衛(wèi)平,王述彬,劉金兵,等.辣椒Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析[J].分子植物育種,2012,10(1): 55-61.

[26] 江 彪,婁群峰,刁衛(wèi)平,等.黃瓜屬Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析[J].園藝學報,2008,35(8): 1147-1154.

[27] 張靖國,胡紅菊,田 瑞,等.梨Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2012,51(9): 4388-4390.

[28] STEINHAUER D A,HOLLAND J J.Direct method for quantitation of extreme polymerase error frequencies at selected single base sites in viral RNA[J].Journal of Virology,1986,57:219-228.

[29] 肖 棟,侯喜林,馬景蕃,等.不結(jié)球白菜Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子序列的克隆及表達[J].西北植物學報,2009,29(4):643-649.

[30] DOOLITTLE R F,FENG D F,JOHNSON M S,et al.Origins and evolutionary relationship of retoviruses[J].The Quarterly Review of Biology,1989,64:1-30.

[31] KUMAR A.The evolution of plant retroviruses:moving to green pasture[J].Trends in Plant Science,1998,3:371-374.

[32] GRANDBASTIEN M A.Retroelements in higher plants[J].Trends in Genetics,1992,8:103-108.

(責任編輯:張明霞)

Cloning and alignment of sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from

Benincasa hispida var.chieh-qua ZHAO Qin①,②,XIE Dasen①,JIANG Biao,LUO Shaobo,PENG Qingwu,LI Mingzhu(Vegetable Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640,China),J.Plant Resour.&Environ.2014,23(4):17-26

Nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon in genomic DNA from eight lines of Benincasa hispida var.chieh-qua How was amplified,system evolution and homology of nucleotide sequence and translated amino acid sequence of 29 cloning products obtained from line A39FA were analyzed,and 29 amino acid sequences were aligned.The amplification results show that genomic DNA from eight lines of B.hispida var.chieh-qua all includes reverse transcriptase nucleotide fragment with length about 260 bp.Length of 29 nucleotide sequences(from CqRt1 to CqRt29)of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon obtained from line A39FA is 247-267 bp with homologous rate of 46.2%-98.1%,while homologous rate of their amino acid sequences is 26.7%-98.8%.The sequence analysis results show that number of base A,T,G and C in nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from B.hispida var.chieh-qua is 65-96,47-92,45-74 and 32-49,respectively.All sequences are rich in base A and T,and AT/GC ratio is 1.35-2.33.Deletion mutation is the main reason inducing differences in length of nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from B.hispida var.chieh-qua,and obvious differences in sequence length and base composition indicate that there is high heterogeneity in nucleotide sequence of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposon from B.hispida var.chieh-qua.There is stop codon mutation in 21 sequences and frame shift mutation in 12 sequences from translated amino acid sequence,which indicates that Ty1-copia-like retrotransposon is the hot spot in sequence recombination within B.hispida var.chieh-qua genome.29 nucleotide sequences of reverse transcriptase can be divided into 5 families,containing 16,4,4,4 and 1 sequences,respectively.Family 1 might be a retrotransposon family with transposition activity,while number of reverse transcriptase sequence with transposition activity only accounts for 20.69%of total number of sequences.The alignment result on 1-2 amino acid sequences in each family of Ty1-copia-like retrotransposons from B.hispida var.chiehqua and that of other 15 species shows higher homology.It is indicated that B.hispida var.chieh-qua and other species may possess the same origin,and Ty1-copia-like retrotransposon can be horizontally transferred among different taxa.

Benincasa hispida var.chieh-qua How;Ty1-copia-like retrotransposon;reverse transcriptase;sequence analysis;homology;system evolution

Q785;S542.9

A

1674-7895(2014)04-0017-10

10.3969/j.issn.1674-7895.2014.04.03

2013-12-19

國家自然科學基金資助項目(31311643);廣州市珠江科技新星專項資助項目(2013086)

趙 芹(1982—),女,山東泰安人,博士,副研究員,主要從事蔬菜病理學與抗病育種方面的研究。謝大森(1970—),男,江西遂川人,博士,研究員,主要從事瓜類抗病育種及生物技術(shù)方面的研究。

①并列第一作者

②通信作者E-mail:zhaoqin0802@126.com