鹽度對耐鹽莢膜紅細菌光合色素組分積累的調(diào)控作用

林志華，趙春貴，楊素萍，＊

（1.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；2.華僑大學 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021）

不產(chǎn)氧光合細菌（APB）代謝方式靈活多樣，可營光能自養(yǎng)和異養(yǎng)、化能自養(yǎng)和異養(yǎng)生長，不僅是光合作用和生物固氮等機理研究的模型生物［1－2］，而且在畜禽、水產(chǎn)和農(nóng)業(yè)種植等領(lǐng)域也顯示出誘人的應(yīng)用前景。APB富含的細菌葉綠素（BChl）和類胡蘿卜素（Car）是構(gòu)成光合作用光系統(tǒng)的最主要功能成分，在光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化成化學能的過程中具有至關(guān)重要的作用。自從Cohen-Bazire等首次開展光合色素合成調(diào)控研究以來［3］，APB光合色素和色素蛋白復(fù)合體的環(huán)境適應(yīng)性調(diào)控研究一直是國際研究熱點，例如：在Rhodobacter sphaeroides、R.capsulatus和Rubrivivax gelatinosus等菌種中相繼發(fā)現(xiàn)App A／PpsR、PrrBA、Fnr L、Reg AB、CrtJ、Aer R和Fix LJ-K等調(diào)控系統(tǒng)或者信號蛋白，基本闡明了光合色素合成的光氧調(diào)控機制［4－7］；Mizoguchi和Harada等揭示了BChl a合成的最后4步反應(yīng)，又進一步闡明紫細菌中普遍積累這4種BChl a相應(yīng)的4種細菌脫鎂葉綠素（BPhe）a，但由于菌株的差異和環(huán)境因子的不同，光合色素的組成和含量也有較大差異［8－9］；在Rhodopseudomonas palustris 中，隨光強升高，NBRC100419菌株積累的 Lycopene和3，4-Didehydrorhodopin含量升高，Spirilloxanthin含量降低，而在 Rits、CGA009、Morita和Rhodospirillum rubrum S1等菌株中則表現(xiàn)出相反結(jié)果［10］。由此可見，在不同的菌株中，光和氧對細胞內(nèi)光合色素的積累呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。除此之外，也有許多關(guān)于營養(yǎng)基質(zhì)以及APB生長抑制劑等對光合色素調(diào)控的報道［11－12］。鹽度也是重要環(huán)境因子，對微生物的生長具有重要作用，依據(jù)鹽的依賴性和耐受性不同，可分為非嗜鹽、輕度嗜鹽、中度嗜鹽和極端嗜鹽微生物［13－14］。鹽對APB生長代謝影響的研究已有很多報道，主要集中在菌株耐鹽能力，以及細胞內(nèi)相容性溶質(zhì)和細胞膜脂質(zhì)成分等耐鹽機制等方面［15－17］，對光合生物光合色素調(diào)控雖然也有許多研究，但主要集中在植物、藻類和藍細菌［18－20］，尚未見到鹽對APB光合色素組分和含量影響規(guī)律的系統(tǒng)報道。本課題組從新疆鹽堿土壤中分離到一株能夠耐鹽Rhodobacter.capsulatus XJ-1菌株，在前期光和氧調(diào)控光合色素合成研究基礎(chǔ)上［21］，進一步研究了鹽度對XJ-1菌株生長、BChl和Car合成的調(diào)控作用，為進一步進行鹽度調(diào)控光合基因表達的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

莢膜紅細菌XJ-1由本實驗室分離、鑒定并保存，GenBank登錄號為 HM370064.

1.2 培養(yǎng)基

采用改良的Ormerod培養(yǎng)基［22］，用2.46 g／L乙酸鈉取代其中的6.0 g／L蘋果酸鈉，以1.0 g／L谷氨酸鈉為氮源，p H 7.0。

1.3 NaCl對生長的影響

培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的NaCl。接種量為1%，設(shè)3個重復(fù)，置28℃，2500 lx光照厭氧培養(yǎng)。不同時間取樣，于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計（MAPADA）測定菌體生物量和活細胞吸收光譜。每組實驗重復(fù)3次取平均值。

1.4 生物量的測定

采用比濁法，用1 cm石英比色杯于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計上測定波長660 nm處的光密度（OD660），以O(shè)D660表示菌體生物量。

1.5 活細胞吸收光譜測定

離心收集光照厭氧培養(yǎng)物菌體細胞，于p H 7.5，10 mmol／L Tris-HC1緩沖液洗滌2次，懸浮于質(zhì)量60%蔗糖溶液，用光程為1 cm石英比色杯，于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計上進行波長掃描。

1.6 色素含量測定

離心收集光照厭氧液體培養(yǎng)物菌體細胞，蒸餾水洗滌3次。菌體依次用甲醇、丙酮甲醇 （7∶2，V／V）和丙酮各提取1次。離心收集上清，殘余物繼續(xù)依次加入提取劑重復(fù)上述處理過程，最后合并提取液。Car的定量按Jessen公式進行計算，C＝（D·V·f×10）／2 500，其中C為Car量（mg），V 為提取液總體積（m L），f為稀釋倍數(shù)，D為Car最大吸收峰的光密度，2 500為Car平均消光系數(shù)。BChl含量參Beer-Lambert-Bouguer定律進行計算，C＝ D·V·f／（a·L）×103，其中a為消光系數(shù)（l·g－1·cm－1），L 為光程（cm）。全色素總量是Car總量和BChl總量之和。色素提取在黑暗中進行［23］。每組實驗重復(fù)3次取平均值。

1.7 色素組分的TLC分析

色素提取液經(jīng)減壓蒸發(fā)干燥，用乙醚溶解，在硅膠G板上進行點樣，展層劑為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇（8∶0.75∶0.2∶0.8∶0.25，V／V），展層結(jié)束后立即拍照，得到色素的TLC指紋圖譜圖像，再用Gel-Pro analyzer軟件進行灰度分析［23］。

1.8 色素組分的鑒定

從TLC層析板上刮取各條帶色素，溶于丙酮中，充分振蕩，離心取上清，用光程為0.2 cm石英比色杯，于UV-2102PCS紫外可見分光光度計上進行波長掃描。依據(jù)吸收光譜、極性、球形烯合成途徑和文獻數(shù)據(jù)對色素組分進行鑒定。

2 結(jié)果和分析

2.1 NaCl對菌株XJ-1生長的影響

如圖1A所示，隨NaCl濃度增加至0.2 mol／L時，菌體的生長速率和最終生物量逐漸升高并達到最大，繼續(xù)增加NaCl濃度，菌體的生長速率和最終生物量則逐漸降低。菌株XJ-1生長不需要NaCl即可良好生長，最適NaCl濃度為0.2 mol／L，達到0.4 mol／L NaCl時，菌體仍能生長。這表明菌株XJ-1是一株耐鹽菌，與文獻報道的R.capsulatus E1F1菌株的耐鹽特性有差異［24］。

Fig.1 Effect of NaCl concentrations on cell growth（A），absorption spectra of living cells（B）and pigment contents of strain XJ-1（C）圖1 NaCl對菌體生長（A）、活細胞吸收光譜（B）、光合色素含量（C）的影響

2.2 NaCl對菌株XJ-1吸收光譜的影響

菌株XJ-1在含有NaCl的培養(yǎng)基中光照厭氧生長72 h，液體培養(yǎng)物呈黃棕色，其活細胞吸收光譜如圖1B所示。培養(yǎng)基中未添加NaCl時，細胞呈現(xiàn)376 nm、590 nm、804 nm和860 nm BChl系BChl a特征光譜和447 nm、480 nm和510 nm球形烯系Car特征光譜。當培養(yǎng)基中含有≤0.3 mol／L NaCl時，與對照相比，各特征峰未見明顯變化，位移在0～4 nm內(nèi)，當含有0.4 mol／L NaCl時，僅顯示微小的802 nm和863 nm吸收峰，其他色素峰均不明顯。

2.3 NaCl對菌體色素含量的影響

如圖1C所示，當NaCl濃度為0～0.2 mol／L時，隨著鹽度增加，菌體積累的BChl a和Car含量逐漸升高，若繼續(xù)增加NaCl濃度，菌體積累的BChl a和Car含量則逐漸降低。

2.4 色素組分的TLC分析

菌株XJ-1光合色素的薄層層析（TLC）如圖2A所示，色素TLC圖譜呈現(xiàn)分辨良好的6條色帶，色帶的顏色分別為綠色（T1）、紫色（T2）、紫色（T3）、黃色（T4）、紅色（T5）和黃色（T6）。在含有0.2和0.4 mol／L NaCl培養(yǎng)基中，菌體積累6種主要的色素組分，與未添加NaCl培養(yǎng)物對照相比（CK），鹽濃度下菌體細胞又新合成了一種紫色條帶（T2）。

TLC圖譜各色帶吸收光譜如圖2B所示，依據(jù)吸收光譜特征吸收峰數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)，T1鑒定為BChl a衍生物，T2和T3為細菌脫鎂葉綠素（Bphe），但 T2特征吸收峰為356 nm、384 nm、526 nm、681 nm和738 nm，與文獻報道數(shù)據(jù)有所差異［8－9］；T4和T6分別為羥基球形烯（OH-SE）和球形烯（SE），T5為球形烯酮（SO）［4，21］。

利用Gel-Pro analyzer軟件將TLC圖譜轉(zhuǎn)化為色素的灰度（Intensity）對Rf的曲線，如圖2C所示。用各色素條帶的灰度的相對面積表示其相對含量，如圖2D所示。未添加NaCl時，菌體細胞主要積累5種色素組分，分別為BChl a、Bphe、OH-SE、SO和SE，其中Bphe和OH-SE相對含量很低。當NaCl濃度為0.2和0.4 mol／L時，菌體細胞額外積累了一種Bphe組分。隨著NaCl濃度升高，菌體積累的BChl a和SE的相對含量降低，2種Bphe組分的相對含量則增加，而OH-SE和SO則呈先升后降的趨勢。由此可見，菌株XJ-1光合色素的積累對鹽度變化的響應(yīng)靈敏，隨著鹽度的變化，菌體光合色素的積累量與菌體的生長相關(guān)聯(lián)，光合色素的組分和相對含量也隨之發(fā)生了規(guī)律性的變化。

Fig.2 Profile of pigment fingerprints on TLC （A），absorption spectra of pigment fingerprints from TLC（B）intensity curve of pigment fingerprintings on TLC （C）and pigment relative contents（D）.L1 and L2 represent 0.2 and 0.4 mol／L NaCl，respectively圖2 菌株XJ-1的色素TLC指紋圖譜（A）、TLC各條帶吸收圖譜（B）、TLC色素指紋圖譜的圖像灰度分析曲線（C）和色素組分的相對含量（D）

3 討論

APB類群廣泛分布于自然環(huán)境中，從淡水到飽和鹵水鹽濃度范圍都能發(fā)現(xiàn)它們。已有研究表明，自然生境中的鹽濃度是決定特定APB種類生長繁殖的一個重要的選擇性因子。莢膜紅細菌廣泛分布于富含有機物的淡水水體和土壤環(huán)境中［25］，耐鹽能力較低，Ige~no等較為詳細地報道了一株具有耐鹽能力的R.capsulatus E1F1菌株，無鹽時生長最好，在0.1～0.3 mol／L NaCl范圍內(nèi)，隨鹽度增加，生長逐漸受到抑制［24］。本研究的XJ-1菌株最適生長的NaCl濃度為0.2 mol／L，與E1F1菌株的耐鹽特性明顯不同。

眾所周知，光合色素是光合生物營光合作用生長的核心功能成分，生物體內(nèi)積累的光合色素受環(huán)境因子調(diào)控。APB富含BChl和Car兩大類光合色素，其結(jié)構(gòu)明顯不同于植物、藻類和藍細菌的光合色素。關(guān)于鹽對光合色素影響的報道主要集中在植物、藻類和藍細菌，如在0.05～0.2 mol／L NaCl環(huán)境中，隨濃度升高，泡桐無性系葉綠素和類胡蘿卜素含量呈下降趨勢［18］。Singh等研究表明，0.2 mol／L NaCl抑制藍細菌（Fremyella diplosiphon）葉綠素的積累［19］。目前尚未見到鹽對APB光合色素響應(yīng)研究的系統(tǒng)報道。本研究結(jié)果表明：不同鹽度對XJ-1菌株的生長和光合色素的合成具有明顯的影響，0～0.2 mol／L NaCl范圍內(nèi)，隨鹽度增加，菌體的生長速率、最終生物量以及積累的BChl a和Car含量升高，繼續(xù)增加鹽度，菌體生長速率、最終生物量以及積累的BChl a和Car含量又逐漸降低。

最近研究表明：在紫細菌中普遍存在4種 BChl a 中間產(chǎn)物 BChl aGG、BChl aDHGG、BChl aTHGG和 BChl aP，但4種BChl a的相對含量因環(huán)境條件和菌株而異［8－9］；另外，菌體中也積累4種 BChl a相應(yīng)的 BPhe a，主要分布于反應(yīng)中心（RC）復(fù)合體中，其含量遠遠低于相應(yīng)的BChl a含量，但BPhe在細胞內(nèi)的形成機制尚不清楚［8］。本課題組前期研究結(jié)果表明：在光照厭氧和黑暗好氧條件下，該菌株只積累1種BChl a和1種Bphe，而在光照好氧條件下，能夠積累1種BChl a和2種Bphe［21］。而本研究表明：在無添加NaCl的光照條件下，菌體只積累1種BChl a和1種Bphe，隨著NaCl升高，BChl a相對含量逐漸降低，又積累了另外1種Bphe，這2種Bphe相對含量逐漸增加，與光照好氧條件下積累兩種Bphe的現(xiàn)象一致。由于紫細菌中積累的4種BChl a或4種Bphe的吸收光譜基本一致，究竟積累哪種BChl a和Bphe還有待于進一步研究。Rba.capsulatus XJ-1分離自鹽堿環(huán)境，具有耐鹽性，而APB積累的光合色素是環(huán)境調(diào)控和細胞內(nèi)生理代謝的綜合體現(xiàn)，由此，我們認為在NaCl環(huán)境中，菌株XJ-1大量合成和積累BPhe與其環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)，光合色素對NaCl的響應(yīng)機制還有待于進一步研究。

［1］ 楊素萍，林志華，崔小華，等.不產(chǎn)氧光合細菌的分類學進展［J］.微生物學報，2009，48（11）：1562-1566.

［2］ Czapla M，Cieluch E，Borek A，et al.Catalytically-relevant Electron Transfer Between two Hemes bL in the hybrid Cytochrome bc1-like Complex Containing a Fusion of Rhodobacter sphaeroides and Capsulatus Cytochromes b ［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1827（6）：751-760.

［3］ Cohen-Bazire G W，Sistrom W R，Stanier R Y.Kinetic Studies of Pigment Synthesis by Non-sulfur Purple Bacteria［J］.J Cell Comp Physiol，1957，49：25-68.

［4］ Yeliseev A A，Eraso J M，Kaplan S.Differential Carotenoid Composition of the B875 and B800-850 Photosynthetic Antenna Complexes in Rhodobacter Sphaeroides 2.4.1：Involvement of Spheroidene and Spheroidenone in Adaptation to Changes in Light intensity and Oxygen Availability［J］.J Bacteriol，1996，178（20）：5877-5883.

［5］ Metz S，Jager A，Klug G.In Vivo Sensitivity of Blue-light-dependent Signaling Mediated by App A／PpsR or PrrB／Prr A in Rhodobacter sphaeroides ［J］.J Bacteriol，2009，191（13）：4473-4477.

［6］ Pandey R，F(xiàn)lockerzi D，Hauser M J，et al.An Extended Model for the Repression of Photosynthesis Genes by the App A／PpsR System in Rhodobacter sphaeroides ［J］.FEBS，2012，279（18）：3449-3461.

［7］ Yin L，Dragnea V，F(xiàn)eldman G，et al.Redox and Light Control the Heme-sensing Activity of App A ［J］.MBio，2013，doi：10.1128／mBio.00563-13.

［8］ Mizoguchi T，Isaji M，Harada J，et al.Isolation and Pigment Composition of the Reaction Centers from Purple Photosynthetic Bacterium Rhodopseudomonas Palustris Species［J］.Biochim Biophys Acta （BBA）-Bioenergetics，2012，1817（3）：395-400.

［9］ Harada J，Mizoguchi T，Yoshida S，et al.Composition and Localization of Bacteriochlorophyll a Intermediates in the Purple Photosynthetic Bacterium Rhodopseudomonas sp.Rits［J］.Photosynth Res，2008，95（2-3）：213-221.

［10］ Mizoguchi T，Isaji M，Harada J，et al Identification of 3，4-didehydrorhodopin as Major Carotenoid in Rhodopseudomonas species［J］.Photochem Photobiol Sciences，2008，7（4）：492-497.

［11］ Gall A，Henry S，Takaichi S，et al.Preferential Incorporation of Coloured-carotenoids Occurs in the LH2 complexes from Non-sulphur Purple Bacteria under Carotenoid-limiting Conditions［J］.Photosyn Research，2005，86（1）：25-35.

［12］ Hakobyan L，Gabrielyan L，Trchounian A.Bio-hydrogen Production and the F0F1-ATPase activity of Rhodobacter Sphaeroides：Effects of Various Heavy Metal Ions［J］.International J Hydro Energy，2012，37（23）：17794-17800.

［13］ Imhoff J F.Osmotic Adaptation in Halophilic and Halotolerant Microorganism［M］／／Vreeland R H，Hochstein L I.The Biology of Halophilic Bacteria.Boca Raton：CRC Press，1993：211-253.

［14］ Oren A.Life at High Salt Concentrations［M］.Rosenberg E，DeLong E F，Lory S，et al.The Prokaryotes.New York：Springer，2013：421-440.

［15］ Imhoff J F.True Marine and Halophilic Anoxygenic Phototrophic Bacteria［J］.Arch Microbiol，2001，176（4）：243-254.

［16］ 崔小華，林志華，楊素萍.嗜鹽紫色硫細菌283-1的耐鹽機制［J］.山西農(nóng)業(yè)大學學報，2012，32（3）：228-231.

［17］ Thiemann B，Imhoff J F.The Effect of Salt on the Lipid Composition of Ectothiorhodospira ［J］.Arch Microbiol，1991，156（5）：376-384.

［18］ Miladinova K，Ivanova K，Georgieva T，et al.The Salinity Effect on Morphology and Pigments Content in Three Paulownia Clones Grown ex itro ［J］.Bulg J Agric Sci，2013，19（2）：52-56.

［19］ Singh S P，Montgomery B L.Salinity Impacts Photosynthetic Pigmentation and Cellular Morphology Changes by Distinct Mechanisms in Fremyella diplosiphon ［J］.Biochem Bioph Res Co，2013，433（1）：84-89.

［20］ 江靈芝，孫雪，王瑋蔚，等.鹽度對蛋白核小球藻生長、葉綠素熒光參數(shù)及代謝酶的影響［J］.寧波大學學報：理工版，2013，26（3）：28-29.

［21］ Lin Z，Cui X，Zhao C，et al.Pigments Accumulation Via Light and Oxygen in Rhodobacter capsulatus Strain XJ-1 Isolated from Saline Soil［J］.J Basic Microbiol，2013，doi：10.1002／jobm.201200565.

［22］ Ormerod J G，Ormerod K S，Gest H.Light Dependent Utilization of Organic Compounds and Photoproduction of Molecular Hydrogen by Photosynthetic Bacteria：Relationships with Nitrogen Metabolism ［J］.Arch Biochem Biophys，1961，94（3）：449-463.

［23］ 卓民權(quán)，趙春貴，程茜茹，等.紫細菌光合色素指紋圖譜的建立與色素分析［J］.微生物學報，2012，52（6）：760-768.

［24］ Ige~no M I，Moral C G，Castillo F，et al.Halotolerance of the Phototrophic Bacterium Rhodobacter capsulatus E1F1 is Dependent on the Nitrogen Source［J］.Appl Environ.Microbiol，1995，61（8）：2970-2975.

［25］ Imhoff J F.Genus Rhodobacter［M］／／Garrity G M.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，2nd ed，vol.2 part C.New York：Springer，2005：161-167.