南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58代謝產(chǎn)物研究

楊建香，邱聲祥，義祥輝，佘志剛，林永成

(1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650；2. 桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西 桂林 541001；3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275）

南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58代謝產(chǎn)物研究

楊建香1,2，邱聲祥1，義祥輝2，佘志剛3，林永成3

(1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650；2. 桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西 桂林 541001；3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275）

研究南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58的代謝產(chǎn)物。采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等進(jìn)行分離純化，并通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。從南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58的菌體中分離得到6個(gè)代謝產(chǎn)物。經(jīng)波譜解析，分別為tetracenomycin D (1)，alternariol monomethyl ether (2)，dehydroaltenusin(3)，5-O-methylbostrycoidin(4)，bostrycoidin(5)，環(huán)(苯丙-酪)肽(6)。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)人體口腔癌細(xì)胞( KB, KBv)抑制的IC50值分別為8μg·mL-1和10μg·mL-1。所有化合物均首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58中分離得到。

紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

海洋微生物由于生活在高鹽、高壓的特殊環(huán)境中，具有獨(dú)特的代謝方式[1]，而微生物中的紅樹林是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶潮間帶的海洋木本植物群落，素有海上森林之美稱，是世界上珍稀瀕危的植物，具有很高的觀賞和科考價(jià)值。由于紅樹林獨(dú)特的生理生態(tài)，使其具有獨(dú)特的代謝過(guò)程、代謝產(chǎn)物和獨(dú)特的共生菌，這些共生菌同樣能產(chǎn)生極其豐富的新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，紅樹林內(nèi)生真菌已經(jīng)被證明是活性海洋天然產(chǎn)物的重要來(lái)源[2]。本研究組已對(duì)我國(guó)南海紅樹林內(nèi)生真菌中的活性物質(zhì)進(jìn)行了多年的研究，分離出了一批骨架新穎、生物活性較好的化合物[3-6]。

本文對(duì)南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從菌體中分離得到6個(gè)化合物：tetracenomycin D (1)，alternariol monomethyl ether (2)，dehydroaltenusin(3)，5-O-methylbostrycoidin(4)，bostrycoidin(5)，環(huán)(苯丙-酪)肽(6)。通過(guò)MS、NMR等波譜分析方法確定了它們的結(jié)構(gòu)（圖1）。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)人體口腔癌細(xì)胞( KB, KBv)抑制的IC50值分別為8μg·mL-1和10μg·mL-1。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of compounds 1～6

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

INOVA-500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀，INOVA-300NB核磁共振儀，VGZAB-HS雙聚焦質(zhì)譜儀，Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀，ThermoMAT95XP高分辨質(zhì)譜儀，X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀。所用試劑均為化學(xué)純，溶劑經(jīng)重蒸后使用。柱層析硅膠為0.048～0.075mm硅膠，硅膠H，薄層硅膠GF254。

1.2 菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌ZH-58采自廣東省珠海市，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsis sp.)，保存于中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10g·L-1，蛋白胨2g·L-1，酵母膏1g·L-1，粗海鹽2g·L-1，pH7.0。500mL三角瓶?jī)?nèi)裝培養(yǎng)基250mL，1.25×105Pa滅菌30min后接種140L，在25℃靜置培養(yǎng)30d。分別收集發(fā)酵液和菌體。

1.3 提取與分離

140L發(fā)酵物過(guò)濾得菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠(0.048～0.075mm)進(jìn)行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度加壓洗脫。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化。從菌體粗提物(約20g)分離得到化合物1 (7mg)，2 (8mg), 3 (12mg)，4 (7mg)，5 (9mg)，6 (14mg)。

1.4 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法[7]測(cè)定了化合物1對(duì)KB和KBv細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。從母液開始, 依次4倍稀釋,共5個(gè)梯度。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB和KBv細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔100μL(約1×104個(gè)細(xì)胞·孔-1)， 6 h后加入不同濃度藥物100μL，每一濃度3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后加入MTT 10μL(質(zhì)量濃度為5mg·mL-1)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100μL后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定492nm處吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%，KB和KBv細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院的符立梧教授測(cè)試。

1.5 化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

化合物1：紅色固體，mp：210～212℃。EIMS：350；1H NMR (300MHz，CDCl3)：13.35(brs，1H)，12.44(brs，1H)，12.35(brs，1H)，7.69(d，3.3，1H)，7.52(d，3.3，1H)，7.42(d，2.4，1H)，7.14(s，1H)，6.71(d，2.4，1H)，3.95(s，3H)，2.37(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：185.0(C)，182.2(C)，165.5(C)，162.9(C)， 162.2(C)，157.6(C)， 139.2(C)，136.1(C)，129.5(C)，127.6(C)，126.9(C)，125.7(C)，125.0(C)，116.8(CH)，16.1(CH)，114.7(CH)，106.8(CH)，105.4(CH)，55.9(CH3)，25.0(CH3)。

化合物2：無(wú)色針狀晶體，mp：266～268℃，LCMS 273 (M+1)，1HNMR(300MHz， Acetone-d6) δ：2.80(3H，s)，3.97(3H，s)，6.55(1H，d，2.1Hz)，6.68(1H，d，2.1Hz)，6.78(1H，d，1.8 Hz)，7.27(1H，d，1.8 Hz)，11.97(1H，s)，9.34(1H，s)。13C NMR(75 Hz，Acetone-d6) δ：168.3，166.8，166.7，160.2，154.9，134.1，133.3，119.4，107.0，105.6，103.6，100.9，99.3，57.2，26.6。

化合物3：黃色針狀晶體，mp：189～190℃，1H NMR(300MHz，CDCl3) δ：1.76(3H，s)， 3.99(3H，s)，6.28(1H，s)，6.41(1H，s)，6.63(1H，d，2.4Hz)，8.04(1H，s)，6.73(1H，d，2.4Hz)，11.32(1H，s)。13C NMR(75MHz，CDCl3) δ：29.6，56.0，79.1，99.8，103.6，104.3，116.1，120.7，134.9，145.9，152.9，164.5，166.2，167.2，180.8。

化合物4：紅色粉末狀固體，mp：209～210℃；EIMS：299(基峰)，282，270，240，224，198，185，157，140，128，113，77。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ 9.42 (1H， s)，2.77(3H，s)，7.57(1H，s)，3.99(3H，s)，3.93(3H，s)，6.78(1H，s)，13.53(1H，s)。13CNMR(CDCl3，75MHz)：δ：188.2，177.4，164.4，157.9，155.2，149.3，148.7， 138.2，126.2，118.0，116.1，111.5，57.6，56.8，56.8，25.3。

化合物5：紅色粉末狀固體， mp：242～244℃；IR υmax(KBr)：3450，1620，1590，1260，1090，1020， 800cm-1。EIMS m/z：285(基峰)，267，242，211。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ 9.50(1H，s，H-1)，2.80(3H，s，H-3)，7.96(1H，s，H-4)，13.49(1H，s，OH-5)，4.02(3H，s)，6.76(1H，s)，13.20(1H，s)。13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ 186.4，183.9，165.4，161.3，157.9，151.2，143.3，138.7，124.6，117.5，112.3，107.9，100.8， 56.8，22.3。

化合物6：白色固體， mp：291～293℃，EI-MS (m/ z)：310[M]+。1H NMR(DMSO-d6，300MHz) δ：9.04(1H，s)，7.65(2H，brs)，7.26(2H，t，J=7.5Hz)，7.18(1H，t，J=7.5Hz)，7.05(2H，d，J=7.0Hz)，6.85(2H，d，J=8.5Hz)，6.66(2H，d，J=8.5Hz)，3.95 (1H，m)，3.89(1H，m)，2.63(2H，dd，J=14.0，7.0Hz)，2.24(2H，dd，J= 14.0，7.0Hz)。13C NMR(DMSO-d6，75MHz) δ：165.9，165.8，155.8，136.5，130.5，129.5，127.9，126.4，114.8，55.7，55.5，39.2，38.9。

2 結(jié)果與討論

化合物1：紅色固體，mp：210～212℃。EI-MS顯示其分子量為350。其1D NMR顯示出明顯的醌類化合物的特征。1HNMR中，可以看出有3個(gè)活潑羥基 δ 13.35×10-6，12.44×10-6，12.35×10-6；有2組苯環(huán)間位的氫，δ 7.69 (d，3.3，1H)，7.52 (d，3.3，1H) 和δ 7.42 (d，2.4，1H)，6.71(d，2.4，1H)， 還有1個(gè)芳香氫的單峰δ 7.14 (s，1H)。還有氧甲基氫和甲基氫δ 3.95×10-6，2.37×10-6。13CNMR中，除了δ 55.9×10-6，25.0×10-6的甲氧基和甲基峰之外，其它的均為芳香碳和不飽和酮羰基的碳信號(hào)。通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]對(duì)比發(fā)現(xiàn)化合物1與tetracenomycin D的光譜數(shù)據(jù)一致。

化合物2：無(wú)色晶體，EI-MS給出分子離子峰272[M]+，結(jié)合NMR，推出分子式C15H12O5。1HNMR中δ 6.55(d，2.1 Hz，1H)和6.68(d，2.1Hz，1H)以及δ 6.78(d，1.8Hz，1H)和7.27(d，1.8 Hz，1H)表明是2組苯環(huán)的間位氫。1HNMR中δ 2.80(s，3H)，3.97(3H，s)，13CNMR中δ26.6和δ57.2分別對(duì)應(yīng)連在苯環(huán)上的1個(gè)甲基1個(gè)甲氧基。1HNMR中δ 11.97的尖峰，是和羰基形成分子內(nèi)螯合氫鍵的-OH。結(jié)合13C NMR δ 168.3左右的峰，推斷為酯羰基，1HNMR中δ 9.34的1個(gè)低的寬峰，推斷為活潑H，是連接在苯環(huán)上的-OH。根據(jù)以上推斷，對(duì)照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9-10]，確定化合物為alternariol monomethyl ether。

化合物3：黃色針狀晶體，EI-MS給出分子離子峰288。1HNMR在δ 6.23、6.67、6.85、7.05的共扼雙鍵區(qū)也有2組苯環(huán)H，其中2個(gè)是間位偶合，另外2個(gè)為單峰，可能是苯環(huán)上互為對(duì)位的H。在δ 11.32高尖峰是與酯羰基形成氫鍵的羥基，δ 8.04和3.99分別是取代在苯環(huán)上的-OH和-OCH3，δ 1.76(3H，s)處的甲基從位移看不應(yīng)連在苯環(huán)上，可能是和脂肪季碳連接。13C NMR中δ 79.1是一季碳，并與氧相連，推測(cè)δ 1.76處的甲基正是連在其上。另外13CNMR中δ 180.8的羰基碳從位移上看應(yīng)與雙鍵等共軛。查閱文獻(xiàn)[11]，對(duì)照熔點(diǎn)以及波譜數(shù)據(jù)，確定化合物3為dehydroaltenusin。

化合物4：紅色粉末狀固體，1HNMR譜圖比較簡(jiǎn)單，只有7個(gè)單峰，13.53×10-6為螯合羥基峰，9.42、7.57和6.78為3個(gè)孤立的芳香質(zhì)子峰，3.93和3.99為2個(gè)連氧的甲基峰，2.77為連不飽和鍵的甲基峰。13CNMR和DEPT譜圖顯示16個(gè)碳，其中3個(gè)CH3，3個(gè)CH，10個(gè)C。EIMS顯示分子離子峰m/z為299。結(jié)合上面的1DNMR譜圖分析，我們可以推出該化合物的分子式為C16H13NO5，不飽和度為11。文獻(xiàn)查閱后發(fā)現(xiàn)該化合物為一已知的化合物5-O-methylbostrycoidin，其譜圖數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[12]幾乎一致。

化合物5：紅色粉末狀固體，EIMS顯示分子離子峰m/z為285，結(jié)合1DNMR譜圖分析，我們可以推出該化合物的分子式為C15H11NO5。1H NMR譜圖同樣簡(jiǎn)單，只有7個(gè)單峰，不同之處是有2個(gè)螯合羥基峰（13.49，13.20），而只有1個(gè)連氧的甲基峰（4.02），比化合物4多了1個(gè)螯合羥基峰而少了1個(gè)連氧甲基峰。13CNMR和DEPT譜圖顯示只有15個(gè)碳，其中2個(gè)CH3，3個(gè)CH，10個(gè)C。通過(guò)13CNMR和1H NMR分析，該化合物為一已知的化合物bostrycoidin，其譜圖數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)吻合[12-13]。

化合物6：白色固體，EI-MS顯示其分子量為310，結(jié)合NMR分析得出化合物的分子式為：C18H18N2O3。通過(guò)1H NMR(DMSO，TMS)，δ 7.26 (2H，t，J=7.5Hz)，δ 7.18(1H， t，J=7.5Hz)，δ 7.05(2H，d，J=7.0Hz)推斷有1個(gè)單取代的苯環(huán)，δ 7.65 (2H，brs)為2個(gè)活潑氫，δ 3.95 (1H，m)和δ 3.89 (1H，m)為和雜原子相連的氫，δ6.85(2H，d，J=8.5Hz)和δ 6.66(2H，d，J=8.5Hz)暗示還有4個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)上的氫，δ 9.04(1H，s)可能為酚羥基。13C NMR中δ 165.9初步可以證實(shí)是酰胺中的羰基信號(hào)，δ 130.5、129.5、127.9， 114.8也進(jìn)一步證實(shí)了分子中苯環(huán)的存在。通過(guò)1H NMR分析得出化合物中有1個(gè)單取代苯環(huán)和1個(gè)對(duì)位二取代苯環(huán)。對(duì)照文獻(xiàn)[14]，確定化合物6為環(huán)(苯丙-酪)肽。

[1] 周中流.紅樹林底泥放線菌（N2010-37）發(fā)酵液的化學(xué)成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（23）：98-100.

[2] BLUNT J W, COPP B R, MUNRO M H.G, et al．Marine natural products [J]．Natural Product Reports, 2011, 28(2): 196-268.

[3] Huang Z J, Cai X L, Shao C L, et al．Chemistry and weak antimicro bialactivities of Phomopsins produced by mangrove endophytic fungus Phomopsis sp. ZSU- H76[J]. Phytochemistry, 2008, 69(7): 1604-1608.

[4] Huang Z J, Shao C L, Chen Y G, et al．A new isocoumar in from mangrove endophytic fung us(No. dz17) on the South China Sea coast[J]. Chem Nat Comp., 2007, 43(6): 655-658.

[5] Yang R Y, Li C Y, Lin Y C, et al. Lactones from a brown algaendophytic fungus (No.ZZF36) from the South China Sea and their antimicrobial activities[J] . Bioorg Med Chem Lett.，2006, 16(16): 4205-4208.

[6] XU F, Zhang Y, Wang JJ, et al. Benzofuran Derivatives from the Mangrove Endophytic Fungus Xylaria sp. (#2508)[J]. J. Nat.Prod., 2008(71): 1251-1253.

[7] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. Journal of immuno logical methods, 1983, 65(1/2): 55-63. [8] WeberW., ZahnerH., SiebersJ. et al. Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen. 175. Mitteilung. Tetracenomycin C[J]. Archives of microbiolo, 1979, 121(2): 111-116.

[9] Raistrick H., Stickings C.E., Thomas R. s. Studies in the biochemistry of microorganisms. 90. Alternariol and alternariol monomethyl ether, metabolic products of Alternaria tenuis[J]. Biochemical J，1953, 55(3): 421-433.

[10] Koch K., Podlech J., Pfeiffer E., et al. Total synthesis of alternariol[J].J Org Chem., 2005, 70(8): 3275-3276.

[11] Kamisuki, S., Takahashi, S., Mizushina, Y. et al. Total synthesis of dehydroaltenusin[J]. Tetrahedron, 2004, 60 (27):5695-5700.

[12] Steyn, Pieter S., Wessels, Philippus L., Marasas, Walter F. O. Pigments from Fusarium moniliforme Sheldon. Structure and carbon-13 nuclear magnetic resonance assignments of an azaanthraquinone and three naphthoquinones[J]. Tetrahedron, 1979, 35(12): 1551-1555.

[13] YoshikazuYamamoto, YasuhiroKinoshita, G.RanThor, et al. Isofuranonaphtho quinone derivatives from cultures of the lichen Arthonia cinnabarina (DC.) Wallr [J]. Phytochemistry, 2002, 60(7):741-745.

[14] 王雙明，譚寧華，楊亞濱，等.三七環(huán)二肽成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16(5)：383-386.

Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus ZH-58 from South China Sea

YANG Jian-xiang1,2，Qiu Sheng-xiang1， Yi Xiang-hui2，SHE Zhi-gang3， LIN Yong-cheng3
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization ， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China；2. Department of Chemistry and Engineering， Guilin Normal College， Guilin， 541002，China；3. School of Chemistry and Chemical Engineering， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275， China）

Secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No. ZH-58 from the south China sea was studied. The compounds were isolated by column chromatography and identified on the basia of physic-chemical constants and spectral analysis. Six metabolites were obtained and elucidated as tetracenomycin D (1)，alternariol monomethyl ether (2)，dehydroaltenusin(3)，5-O-methylbostrycoidin(4)，bostrycoidin (5 ), cylo(Phe-Tyr) (6). In the preliminary bioassay, 1 showed inhibittory activity on the KB and KBv cell line with IC50values of 8 and 10μg/mL. The six metabolites were obtained from endophytic fungus No. ZH-58 for the first time.

mangrove; endophytic fungus; metabolites

O 629

A

1671-9905(2014)04-0004-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373293）；國(guó)家863計(jì)劃和支撐計(jì)劃項(xiàng)目（201473948）；廣西教育廳科研項(xiàng)目（201204LX497）

楊建香（1979-）， 女，漢族， 博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，電話：020-37082553 18933940283，E-mail: 791011@126.com

2014-02-11