睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān)miRNA研究進展

冉茂良,陳斌,尹杰 ,楊岸奇,蔣明

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,長沙 410128;

2. 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室,湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站,長沙 410125;

3. 中國科學院研究生院,北京 100049

1993年 Lee等[1]首次在線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)了 microRNA (miRNA)—Lin-4基因,Reinhart等[2]于2000年發(fā)現(xiàn)了線蟲的另一個miRNA—Let7基因及其靶基因lin-41,并證實了它們在線蟲發(fā)育過程中的時間控制作用。之后,科研人員開始廣泛關(guān)注 miRNA這一全新的后轉(zhuǎn)錄基因沉默的重要調(diào)節(jié)因子,其調(diào)節(jié)機制主要是通過堿基互補配對原則與靶mRNA結(jié)合后形成雙鏈RNA,從而誘導靶mRNA降解或抑制其翻譯過程[3,4]。目前miRBase已經(jīng)收錄了多種生物的 miRNA,大量研究證實miRNA在生物體生長、發(fā)育和凋亡等過程中具有重要的調(diào)控意義[5]。同生物體其他器官和組織一樣,睪丸的正常發(fā)育和精子生成也會受到激素、生長因子和酶或蛋白質(zhì)的嚴格調(diào)控[6],研究表明,miRNA也調(diào)控著睪丸的正常發(fā)育和精子生成過程。目前,動物睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān) miRNA的研究方法主要集中在綜合利用各種探針設(shè)計和標記技術(shù),同時結(jié)合微陣列芯片、高通量測序、實時熒光定量 PCR等技術(shù)以提高檢測通量、靈敏度和特異性[7]; 研究的主要內(nèi)容多集中于睪丸 miRNA表達的種屬差異性和階段特異性、睪丸 miRNA的表達調(diào)控以及一些miRNA對精子生成的調(diào)節(jié)作用。本文綜述了近年來睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān)miRNA的研究進展,以期為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

1 睪丸miRNA表達的物種差異性

動物體內(nèi)許多miRNA的表達模式是固定的,但在不同物種和組織中這種固定的表達模式卻存在著差異。通過對人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和荷斯坦牛(Holstein Friesian)等動物不同組織miRNA表達譜的比較發(fā)現(xiàn),miRNA在睪丸中的表達存在特異性,主要表現(xiàn)為種類和數(shù)量上的差異(表 1)[8～10]。

研究 miRNA組織特異性表達,也有助于解析miRNA在不同器官和組織中的功能。Liu等[8]對人不同組織中161個miRNA的表達情況采用基因芯片技術(shù)、Real-time PCR、Northern blot和文獻檢索進行了研究,證實miRNA在人體組織中的表達具有特異性,并且在人體睪丸組織中檢測到 112種特異性表達的 miRNA。Mishima等[9]對成年小鼠睪丸和卵巢的miRNA文庫進行了測序,研究miRNA在生殖系統(tǒng)中的表達特點,利用RT-PCR進行驗證,結(jié)果表明 miRNA在組織中的表達具有特異性,并檢測到49種僅在或主要在成年小鼠睪丸組織中表達的miRNA。Huang等[10]采用 Solexa高通量測序技術(shù)對荷斯坦牛睪丸和卵巢中的 miRNA文庫進行了檢測,發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛睪丸中有21個miRNA存在特異性表達。由此可見,睪丸miRNA在不同物種的表達存在特異性。

生物技術(shù)的不斷發(fā)展有助于在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)更多特異性表達的miRNA,例如高通量測序技術(shù)、miRNA表達圖譜分析和生物信息學技術(shù)等[11～13]。Wu等[11]構(gòu)建了成年奶山羊(Capra hircus L.)睪丸組織miRNA文庫,利用 Illumina高通量檢測技術(shù),通過與miRBase 19.0中牛、羊的miRNA對比,在奶山羊睪丸組織中確定了373種保守的miRNA,并發(fā)現(xiàn)91種新配對的 miRNA,利用 qRT-PCR證實其中的 6種 miRNA(miR-10b、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-34c、miR-449b和miR-1468)特異性表達于奶山羊睪丸組織,并且有128種保守的miRNA在奶山羊的睪丸發(fā)育和精子生成的減數(shù)分裂過程中發(fā)揮作用。Yang等[12]采用 Solexa高通量測序技術(shù)對人正常睪丸組織的miRNA進行了測序,檢測出770個已知的和 5個新的 miRNA,并利用 qRT-PCR驗證了其中15個已知的(let-7f-5p、let-7a-5p、miR-34c-5p、miR-22-5p、let-7c、miR-10b-5p、miR-514b-5p、miR-34b-5p、miR-15b-5p、miR-27b-3p、miR-134、miR-15a-5p、miR-889、miR-506-3p、miR-17-5p)和5個新的 miRNA(HT-0117-3p、HT-0016-3p、HT-0072-3p、HT-0041-3p、HT-0010-5p),證實了Solexa高通量測序結(jié)果的可靠性。Abu-Halima等[13]采用 miRNA陣列分析法,發(fā)現(xiàn)與正常睪丸組織相比,病變組織中共有 211種 miRNA存在差異表達,而且qRT-PCR驗證的結(jié)果與miRNA陣列分析結(jié)果一致。

表1 睪丸特征性表達的miRNA

2 睪丸miRNA表達的階段特異性

動物的睪丸發(fā)育大體上經(jīng)歷胎兒期、幼年期、青年期和性成熟期 4個階段,但不同動物睪丸發(fā)育的階段又有一些相對細致的劃分[14]。miRNA在睪丸不同發(fā)育階段的表達模式也呈現(xiàn)出特異性,主要是數(shù)量和種類上的特異性,其正常的表達模式是睪丸發(fā)育和生精功能正常的前提。此外,研究睪丸miRNA表達的階段特異性也能從側(cè)面證實 miRNA對睪丸的發(fā)育、成熟和精子生成具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前多采用基因芯片技術(shù)、高通量測序技術(shù)、生物信息學技術(shù)以及qRT-PCR對睪丸miRNA表達的階段特異性進行研究,但基于動物模型和睪丸發(fā)育時期不盡相同,所采用的實驗方法也有所差異。

Yan等[15]采用基因芯片技術(shù)對小鼠幼齡期(7 d)和成年期(56 d)睪丸中miRNA的表達進行了比較研究,利用qRT-PCR進行驗證,發(fā)現(xiàn)19種miRNA的表達存在顯著差異,在幼齡小鼠中 14種miRNA(miR-411、miR-495、miR-335、miR-434-5p、miR-337、miR-379、miR-127、miR-376a、miR-181d、miR-214、miR-181c、miR-361、let-7e、miR-181b)的表達被顯著上調(diào),5種miRNA(miR-34a、miR-29b、miR-449、miR-34b和 miR-34c)的表達被顯著下調(diào)。Lian等[16]通過構(gòu)建miRNA文庫和Solexa高通量測序技術(shù)對軍牧-1豬(Sus scrofa)幼齡期(30 d)和成年期(180 d)睪丸中miRNA的表達進行了比較研究,共發(fā)現(xiàn) 469種 miRNA,其中新發(fā)現(xiàn) 15種豬特有的miRNA,56種新的候選 miRNA; 在 469種 miRNA中有 122種在幼齡期和成年期的表達顯著不同,其中對隨機選取的10種miRNA(miR-9-1、miR-183、miR-122、miR-145、miR-30a、miR-199b*、let-7c、miR-221、miR-323和 miR-196)進行了 qRT-PCR驗證,其結(jié)果與 Solexa測序分析結(jié)果基本一致,僅miR-9-1和miR-196的兩個結(jié)果趨勢一致。Lou等[17]采用miRNA芯片技術(shù)對長白豬青年期(60 d)和成年期(180 d)睪丸中 miRNA 的表達進行了研究,發(fā)現(xiàn)129種miRNA的表達存在顯著差異,在成年期有51種miRNA的表達上調(diào),78種miRNA的表達下調(diào),對隨機選取的 9 種 miRNA(miR-663、miR-1、miR-762、miR-143、miR-638、miR-145、miR-542-3p、miR-155和miR-705)進行了qRT-PCR驗證,其中僅miR-145呈現(xiàn)出相反的表達譜,其余8種miRNA的表達譜均相同,證明兩種方法所得的結(jié)果具有較高的一致性。Torley等[18]采用生物信息學技術(shù)和 Real-time PCR技術(shù)研究并驗證了綿羊(Ovis aries L.)妊娠胎兒在妊娠初期(第42 d)和中期(第75 d)睪丸中miRNA的表達,共發(fā)現(xiàn) 30 種 miRNA的表達存在顯著差異,其中 13種 miRNA(miR-302d、miR-200c、miR-222、miR-200b、miR-362、miR-99b、miR-485-5p、 miR-382、miR-149、miR-15b、miR-92、miR-17-5p和 miR-107)在妊娠初期的表達顯著升高,17種 miRNA(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-33、miR-211、miR-193a、miR-19a、miR-19b、miR-199b、miR-27a、miR-199a、miR-143、let-7g、miR-22、miR-30e-5p、miR-204、miR-30b和let-7e)在妊娠中期的表達顯著升高。Zhang等[19]采用芯片技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)研究并驗證了人在新生、成年(25歲)和老年(75歲)3個不同時期睪丸中miRNA的表達,發(fā)現(xiàn)新生胎兒、成年人和老年人睪丸中分別有 251、109和 125種miRNA表達,有127種miRNA(如miR-375、miR-208、miR-494、miR-425和 miR-198等)特定表達于新生胎兒睪丸中,而僅有3種(miR-24、miR-27、miR-21)和2種(miR-221、miR-222)miRNA特定表達于成年和老年人的睪丸中,此外有 106種 miRNA(如miR-125b、miR-143、miR-23b和 miR-26a等)廣泛表達于人體睪丸的這3個階段。

綜上所述,目前多采用在高通量克隆測序和基因芯片技術(shù)等基礎(chǔ)上利用RT-PCR或qRT-PCR對實驗結(jié)果進行驗證,研究睪丸中miRNA表達的階段特異性。但是基于取樣的方式、樣本量以及實驗結(jié)果驗證量等因素的限制,研究結(jié)果與miRNA在實體中的表達模式會有不同程度的差異,從而對描繪睪丸miRNA在實體中的表達狀況造成一定程度的困難,有待于科研工作者進一步研究制定更為合理的方法以研究睪丸miRNA的表達模式。

3 睪丸miRNA的表達調(diào)控

睪丸 miRNA不僅對睪丸基因轉(zhuǎn)錄后的表達發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,其自身的表達也會受到細胞內(nèi)外相關(guān)因素的調(diào)控,從而對睪丸發(fā)育和精子生成產(chǎn)生影響。目前,關(guān)于睪丸miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的研究相對較少,但也有一些實驗證實了細胞內(nèi)外的一些因素(例如激素、轉(zhuǎn)錄因子、酶和蛋白等)可以調(diào)控睪丸中miRNA的表達。

研究表明,激素可以調(diào)節(jié)睪丸細胞miRNA的表達。Hu等[20]采用芯片技術(shù)和 qRT-PCR技術(shù)證實了大鼠的一些睪丸類固醇生成細胞中的 miRNA受激素調(diào)節(jié),并且其中的一些miRNA受到多個激素的調(diào)控; 促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno cortico tropic hormone,ACTH)上調(diào) miR-212、miR-182、miR-183、miR-132和 miR-96而下調(diào) miR-466b、miR-214、miR-503 和 miR-27a 的表達; 17α-雌二醇(17α-E2)上調(diào) miR-212、miR-183、miR-182、miR-132、miR-370、miR-377和 miR-96而下調(diào) miR-125b、miR-200b、miR-122、miR-466b、miR-138、miR-214、miR-503和 miR-27a的表達; 地塞米松(dexamethasone)上調(diào)miR-183而下調(diào) miR-200b、miR-122、miR-19a、miR-466b 和 miR-27a 的表達。Panneerdoss等[21]研究表明,雄激素調(diào)節(jié)睪丸支持細胞中的一些miRNA的表達是通過調(diào)節(jié)支持細胞或生殖細胞特定基因的表達而實現(xiàn)的; 通過雄激素抑制和雄激素替代證實雄激素能夠調(diào)節(jié)小鼠睪丸支持細胞中一些 miRNA的表達,上調(diào) miR-201、miR-547、miR-871-3p、miR-878-5p、miR-880、miR-463、miR-741、miR-471-5p、miR-753a、miR-375、miR-25、miR-34c、miR-203和 miR-449a而下調(diào) miR-18a*、miR-328、miR-335-3p和 miR-468的表達。此外,Dai等[22,23]敲除雄性小鼠圓形精子細胞中的GRTH基因(促性腺激素調(diào)節(jié)的睪丸特異 RNA 解旋酶基因)發(fā)現(xiàn),相比于正常小鼠,19個miRNA的表達水平顯著升高,包括Let-7家族、miR-470、miR-34c以及睪丸特異表達的 miR-469,miRNA的初級前體轉(zhuǎn)錄水平也顯著升高,如 pri-let-7d、pri-let-7g、pri-miR-34c、pri-miR-469以及pri-miR-470; 證實GRTH在睪丸精子細胞 miRNA的成熟過程中發(fā)揮著重要的負調(diào)控作用,以維持精子發(fā)生過程中成熟miRNA分子的動態(tài)平衡,從而保證精原細胞能夠順利發(fā)育至成熟的精子。

酶或蛋白質(zhì)同樣也可以調(diào)節(jié)睪丸細胞 miRNA的表達。Wu等[24]研究表明,雄性生殖線中缺乏第2類核糖核酸酶Ⅲ不僅會阻礙成熟 miRNA的形成而且還會導致雄性不育。Tian等[25]研究表明,調(diào)低人惡性多發(fā)性畸胎瘤細胞(NTERA-2)中脆性 X智力低下蛋白(FMRP)的表達可以通過減弱 miR-383與FMRP之間的相互作用而增強miR-383對細胞分化的抑制作用,從而證實FMRP對miR-383的功能存在負向調(diào)節(jié)的作用。Ali等[26]研究表明,APOBEC3(Apolipoprotein B mRNA-editing enzym,catalytic polypeptide like 3)能夠阻滯 DND1(一個RNA結(jié)合蛋白,可介導生殖細胞的存活,抑制生殖細胞腫瘤的形成)的功能以恢復 miR-372和miR-206分別對LATS2和CX43基因的抑制作用,并證明APOBEC3能夠通過調(diào)節(jié)DND1的功能以調(diào)控細胞中miRNA介導的翻譯調(diào)控。此外,轉(zhuǎn)錄因子對睪丸細胞miRNA的表達也起著調(diào)節(jié)作用。Niu等[27]在證實 miR-21對維持睪丸精原干細胞數(shù)量具有重要作用的基礎(chǔ)上,過表達Etv5基因(轉(zhuǎn)錄因子Ets差異基因5)可促進miR-21表達,從而證實ETV5(一種轉(zhuǎn)錄因子)對調(diào)節(jié) miR-21在睪丸精原干細胞中的表達具有重要作用。

4 miRNA對精子生成的調(diào)節(jié)作用

原始生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)來源于胚外上胚層或內(nèi)胚層,作為哺乳動物生殖細胞系(Germ cell lineage)的起源,PGCs形成后即遷移至生殖嵴(胚胎性腺)并在來源于中胚層的體細胞之間定植,隨性腺的分化而大量增殖并分化,并逐漸過渡到前精原細胞(Prospermatogonia),隨后休眠于細胞周期的G1/G0期[28]。在動物出生后的一段時間內(nèi),前精原細胞大量增殖并分化為精原細胞,并且也會有少量的精原干細胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)存在于精原細胞群體中以維持體內(nèi)精子發(fā)生[29]。精原細胞通過一次有絲分裂形成初級精母細胞、兩次減數(shù)分裂形成精子細胞,最終在經(jīng)歷一系列形態(tài)變化過程后形成成熟的精子。研究證實miRNA對精子生成具有重要的調(diào)控作用(表2),且這種調(diào)控作用貫穿于精子生成的整個過程中。如圖 1所示,目前關(guān)于 miRNA對原始生殖細胞至精原細胞的調(diào)控作用的研究較多,而對初級精母細胞至成熟精子細胞的研究還較少。

表2 對精子生成具有調(diào)控作用的miRNA

圖1 部分miRNA在精子生成過程中的作用位點(參考文獻[28]并修改)

調(diào)控PGCs增殖和發(fā)育的miRNA較多,如miR-19a[30]、miR-19b[30]、miR-141[31]、miR- 200a[31]、miR-200c[31]、 miR-let-7 家族(a,d,e,f,g)[31～33]、miR-17-92 簇[34]、miR-106b-25 簇[34]、miR-302-367外,miRNA通常以間接的方式對PGCs進行調(diào)控,腫瘤抑制因子 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是miR-19a和miR-19b的作用靶標之一,而 PTEN可以負向調(diào)控 PGCs增殖[39,40],因此 miR-19a和 miR-19b可以通過調(diào)節(jié)PTEN的表達而調(diào)控 PGCs的增殖?；诓煌膍iRNA具有相同的靶標,因此 miRNA簇內(nèi)部成員miRNA以及miRNA簇之間均存在協(xié)同作用以調(diào)控PGCs的增殖和發(fā)育,miR-141、miR-200a和miR-200c屬于miR-200超家族成員,它們的種子序列相似,被認為在 PGCs的增殖和發(fā)育過程中存在協(xié)同作用[38,31],此外Let-7家族、miR-125a和miR-9對共同的作用靶標—LIN28(miRNA調(diào)節(jié)蛋白,一種高度保守的 RNA 結(jié)合蛋白)有類似的調(diào)控作用,從而推測它們對PGCs的調(diào)控存在協(xié)同作用[38]。

miRNA對由PGCs發(fā)育而來的精原干細胞和精原細胞也有調(diào)控作用。對精原干細胞起調(diào)控作用的miRNA 有 miR-Let-7家族(7,a,b,c,d,e)[41]、miR-21[27]、miR-34c[42]、miR-148[33]等,對精原細胞起調(diào)控作用的 miRNA有 miR-106b-25簇[32]、miR-17-92 簇[32]、miR-221[44]、miR-222[44]和 miR-449[45]等。miRNA對精原干細胞和精原細胞的調(diào)控也存在階段特異性。Huszar等[43]研究發(fā)現(xiàn),miR-146依賴維甲酸(Retinoic acid,RA)信號對精原干細胞的分化具簇[35]、miR-290-295 簇[36]、miR-323[31]和 miR-9[31,37]等。miRNA對PGCs的調(diào)控存在時相性,如miR-141、miR-200a、miR-200c和miR-323等調(diào)控PGCs的早期階段,而 miR-9等調(diào)控 PGCs的晚期階段[38]。此有重要的調(diào)節(jié)作用,其在未分化的精原細胞中的轉(zhuǎn)錄水平是分化過程中的精原細胞的180倍。miRNA對精原干細胞和精原細胞的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)靶標而介導實現(xiàn)的。Yang等[44]研究發(fā)現(xiàn),未分化的精原干細胞向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)化的數(shù)量受到 KIT受體的調(diào)控,而miR-221和miR-222則會抑制KIT受體mRNA和蛋白表達量,從而在保持哺乳動物的精原細胞處于未分化狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用; Bao等[45]研究發(fā)現(xiàn),miR-449和miR-34家族中的miR-34b/c共同作用于E2F轉(zhuǎn)錄因子視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白通路中的基因,從而實現(xiàn)對雄性生殖細胞的調(diào)控作用。此外,miRNA簇或miRNA也協(xié)同調(diào)控精原干細胞和精原細胞的增殖與發(fā)育。Tong等[34]研究發(fā)現(xiàn),雄性生殖細胞中缺乏 miR-17-92簇時會使 miR-106b-25簇中的 miRNAs的表達量劇增,從而表明 miR-106b-25簇和 miR-17-92簇對精原干細胞的調(diào)控存在協(xié)同作用。

miRNA對精子生成過程中初級精母細胞至成熟精子細胞這一發(fā)生階段也存在調(diào)控作用。Yu等[46]研究發(fā)現(xiàn),miR-122a能夠調(diào)節(jié)生殖細胞過渡蛋白2(TNP2)的表達而對精子生成的后期階段發(fā)揮調(diào)控作用。此外也有研究表明,miR-13可以通過增強生精細胞特異性標志物的表達進而促進晚期精子發(fā)生[42]。miR-24通過作用于甲基化 CpG結(jié)合域蛋白6(MBD6)和組蛋白2A家族成員X(H2AX)兩個靶標,而在精子生成過程中的減數(shù)分裂時發(fā)揮潛在的調(diào)控作用[47]。miR-888對維持成熟精子的結(jié)構(gòu)和鞭毛的蠕動具有重要的作用[48]。盡管后期減數(shù)分裂和單倍體生殖細胞是精子生成過程中產(chǎn)生 miRNA的主要源頭[49],但是目前關(guān)于 miRNA對精子生成過程中初級精母細胞至成熟精子細胞這一發(fā)生階段的調(diào)控作用的報道卻較少。此外,miRNA調(diào)控精子發(fā)生過程的階段或時相特異性以及其對精子發(fā)生的調(diào)控途徑也需進一步研究。

miRNA不僅在動物睪丸中的表達具有種屬差異性和發(fā)育階段特異性,其本身在睪丸中的表達受到來自體內(nèi)外各種因素的調(diào)控,而且對動物精子生成也具有重要的調(diào)控作用。以 Let-7家族為例,對miRNA在動物睪丸發(fā)育和精子生成過程中表現(xiàn)出的種屬和發(fā)育階段特異性以及其自身表達調(diào)控和對精子生成的調(diào)控作一詳細闡述。

Let-7家族成員主要包括 Let-7a-1、Let-7a-2、Let-7a-3、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f-1、Let-7g、Let-7i以及miR-98等,已有研究表明Let-7家族對動物細胞分裂分化、器官發(fā)育、心肺系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均有調(diào)控作用[52]。此外,如前文所述,Let-7家族成員對動物睪丸發(fā)育和精子生成也起著不同程度的調(diào)控作用。Let-7家族在睪丸中的表達存在物種差異,如表 1所示,Let-7家族中的miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-let-7a-3、miR-let-7b、miR-let-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g特異性表達于人的睪丸中,在小鼠的睪丸中僅有 let-7g-3p特異性表達,而在荷斯坦牛睪丸中卻不存在特異性表達。Let-7家族在睪丸中的表達也存在階段特異性。Lian等[16]研究表明,Let-7c在軍牧-1豬幼齡期(30 d)和成年期(180 d)睪丸中的表達顯著不同; Torley等[18]研究表明,Let-7g和Let-7e在綿羊胎兒妊娠中期(第75 d)的表達顯著升高而在妊娠初期(第 42 d)卻未發(fā)現(xiàn)有顯著升高現(xiàn)象。Let-7家族在睪丸中的表達也受到體內(nèi)外一些因素的調(diào)節(jié)。Dai等[22,23]研究表明,敲除小鼠圓形精子細胞中的 GRTH基因可導致 Let-7家族的表達水平以及Let-7d和Let-7g的前體轉(zhuǎn)錄水平顯著升高; Piskounova等[53]研究表明,敲除Lin-28基因可促進Let-7的成熟體形成,從而證明Lin-28蛋白可以直接或間接在轉(zhuǎn)錄水平對Let-7進行負調(diào)控。此外,也有研究表明,Let-7家族(a,d,e,f,g)能夠調(diào)控精子生成過程中PGCs增殖和發(fā)育,Let-7家族(7,a,b,c,d,e)能夠調(diào)控精原干細胞和精原細胞的分化和增殖[32,41]。由此可見,Let-7家族成員在睪丸發(fā)育和精子生成過程中均表現(xiàn)出明顯的調(diào)控作用,而且其自身的表達也受到體內(nèi)外一些因素的調(diào)控。

5 展 望

睪丸的正常發(fā)育和生精對保障種群延續(xù)和充分利用優(yōu)良種公畜的精液具有十分重要的作用,而miRNA在睪丸組織發(fā)育和精子生成的各個階段均發(fā)揮著重要的作用,但是這方面的研究卻還處于初步階段。因此,研究miRNA對正常睪丸發(fā)育和精子生成的調(diào)控作用的意義重大,不僅為研究人類和種公畜的生殖疾病的理論基礎(chǔ)做出了很好的補充,還為改善畜牧生產(chǎn)中種公畜的精液品質(zhì)提供了一個新的思路和途徑。

在睪丸miRNA后續(xù)的相關(guān)研究中,應(yīng)當重點開展睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān) miRNA的表達分析和功能驗證等方面的研究。對miRNA的表達譜分析應(yīng)著眼于睪丸發(fā)育和精子生成的不同階段特異性表達的 miRNA,探討睪丸發(fā)育和精子生成過程中的miRNA與精液品質(zhì)的相關(guān)性,篩選 miRNA的分子標記。而對于miRNA的功能驗證,則應(yīng)深入研究功能性miRNA的作用機理和睪丸miRNA的表達受到外界因素(環(huán)境因素、營養(yǎng)因素等)調(diào)控的機制以及怎樣利用miRNA來調(diào)控種公畜睪丸健康和精液品質(zhì)。應(yīng)當將細胞水平和動物機體水平的試驗驗證有機地結(jié)合在 miRNA的研究中,探究抑制和過表達miRNA對睪丸發(fā)育和精子生成的影響?？梢灶A(yù)見,對于種公畜而言,探明miRNA與其靶基因的關(guān)系和miRNA調(diào)控精子生成及精液品質(zhì)的潛在機理,可為在畜牧生產(chǎn)中獲得品質(zhì)優(yōu)良的精液和分子育種提供新的理論依據(jù),與此同時也為治療雄性不育、睪丸癌等各種睪丸疾病提供新的思路。

[1]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,1993,75(5): 843–854.

[2]Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,Pasquinelli AE,Bettinger JC,Rougvie AE,Horvitz HR,Ruvkun G. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature,2000,403(6772):901–906.

[3]王天宇,董園園,李海燕,李校堃. MicroRNAs的分子進化與調(diào)控機制. 遺傳,2010,32(9): 874–880.

[4]孟雅楠,孟麗軍,宋亞娟,劉美玲,張秀軍. 小 RNA分子與精子發(fā)生調(diào)控. 遺傳,2011,33(1): 9–16.

[5]蔡婷,劉志紅,王志新,趙濛,俎紅麗,李金泉. MiRNA在調(diào)控皮膚和毛囊發(fā)育中的作用. 遺傳,2013,35(9):1087–1094.

[6]金曉露,楊建香,李真,劉紅云,劉建新. 乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)miRNA研究進展. 遺傳,2013,35(6): 695–702.

[7]景花,宋沁馨,周國華. MicroRNA定量檢測方法的研究進展. 遺傳,2010,32(1): 31–40.

[8]Liu CG,Calin GA,Meloon B,Gamliel N,Sevignani C,Ferracin M,Dumitru CD,Shimizu M,Croce CM. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(26): 9740–9744.

[9]Mishima T,Takizawa T,Luo SS,Ishibashi O,Kawahigashi Y,Mizuguchi Y,Ishikawa T,Mori M,Kanda T,Goto T,Takizawa T. MicroRNA(miRNA) cloning analysis reveals sex differences in miRNA expression profiles between adult mouse testis and ovary. Reproduction,2008,136(6): 811–822.

[10]Huang J,Ju Z,Li Q,Hou Q,Wang C,Li J,Li R,Wang L,Sun T,Hang S,Gao Y,Hou M,Zhong J. Solexa sequencing of novel and differentially expressed micro-RNAs in testicular and ovarian tissues in holstein Cattle.Int J Biol Sci,2011,7(7): 1016–1026.

[11]Wu J,Zhu H,Song W,Li M,Liu C,Li N,Tang F,Mu H,Liao M,Li X,Guan W,Li X,Hua J. Identification of conservative microRNAs in Saanen dairy goat testis through deep sequencing. Reprod Domest Anim,2014,49(1): 32–40.

[12]Yang Q,Hua J,Wang L,Xu B,Zhang H,Ye N,Zhang ZQ,Yu DX,Cooke HJ,Zhang YW,Shi QH. MicroRNA and piRNA profiles in normal human testis detected by next generation equencing. PLoS ONE,2013,8(6): e66809.

[13]Abu-Halima M,Backes C,Leidinger P,Keller A,Lubbad AM,Hammadeh M,Meese E. MicroRNA expression profiles in human testicular tissues of infertile men with different histopathologic patterns. Fertil Steril, 2014,101(1): 78–86.

[14]BarakatB,ItmanC,MendisSH,LovelandKL. Activins and inhibins in mammalian testis development: new models,new insights. Mol Cell Endocrinol,2012,359(1–2):66–77.

[15]Yan N,Lu Y,Sun H,Tao D,Zhang S,Liu W,Ma Y. A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues.Reproduction,2007,134(1): 73–79.

[16]Lian C,Sun B,Niu S,Yang R,Liu B,Lu C,Meng J,Qiu Z,Zhang L,Zhao Z. A comparative profile of the micro-RNA transcriptome in immature and mature porcine testes using Solexa deep sequencing. FEBS J,2012,279(6):964–975.

[17]Luo L,Ye L,Liu G,Shao G,Zheng R,Ren Z,Zuo B,Xu D,Lei M,Jiang S,Deng C,Xiong Y,Li F. Microarray-based approach identifies differentially expressed microRNAs in porcine sexually immature and mature testes. PLoS ONE,2010,5(8): e11744.

[18]Torley KJ,da Silveira JC,Smith P,Anthony RV,Veeramachaneni DN,Winger QA,Bouma GJ. Expression of miRNAs in ovine fetal gonads: potential role in gonadal differentiation. Reprod Biol Endocrinol,2011,9(2): 1–11.

[19]Zhang J,Liu Q,Zhang W,Li J,Li Z,Tang Z,Li Y,Han C,Hall SH,Zhang Y. Comparative profiling of genes and miRNAs expressed in the newborn,young adult,and aged human epididymides. Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2010,42(2): 145–153.

[20]HuZ,ShenWJ,CortezY,TangX,LiuLF,KraemerFB,AzharS,Mari B. Hormonal regulation of microRNA expression in steroid producing cells of the ovary,testis and adrenal gland. PLoS ONE, 2013,8(10): e78040.

[21]Panneerdoss S,Chang YF,Buddavarapu KC,Chen HI,Shetty G,Wang H,Chen Y,Kumar TR,Rao MK,Lobaccaro JA. Androgen-responsive microRNAs in mouse sertoli cells. PLoS ONE,2012,7(7): e41146.

[22]戴立勝. GRTH/DDX25通過調(diào)節(jié)睪丸特異 miRNA-469控制雄性生殖細胞的發(fā)育. 長春: 吉林大學,2011:39–85.

[23]Dai L,Tsai-Morris CH,Sato H,Villar J,Kang JH,Zhang J,Dufau ML. Testis-specific miRNA-469 up-regulated in gonadotropin-regulated testicular RNA helicase (GRTH/DDX25)-nullmice silences transition protein 2 and protamine 2 messages at sites within coding region: implications of its role in germ cell development. J Biol Chem,2011,286(52): 44306–443018.

[24]Wu Q,Song R,Ortogero N,Zheng H,Evanoff R,Small CL,Griswold MD,Namekawa SH,Royo H,Turner JM,Yan W. The RNaseIII enzyme DROSHA is essential for microRNA production and spermatogenesis. J Biol Chem,2012,287(30): 25173–25190.

[25]Tian H,Cao YX,Zhang XS,Liao WP,Yi YH,Lian J,Liu L,Huang HL,Liu WJ,Yin MM,Liang M,Shan G,Sun F. The targeting and functions of miRNA-383 are mediated by FMRP during spermatogenesis. Cell Death Dis,2013,4: e617.

[26]Ali S,Karki N,Bhattacharya C,Zhu R,MacDuff DA,Stenglein MD,Schumacher AJ,Demorest ZL,Harris RS,Matin A,Aggarwal S. APOBEC3 inhibits DEAD-END function to regulate microRNA activity. BMC Mol Biol,2013,14: 16.

[27]Niu Z,Goodyear SM,Rao S,WuX,Tobias JW,Avarbock MR,Brinster RL. MicroRNA-21 regulates the self-renewal of mouse spermatogonial stem cells. Proc Nat Acad Sci USA,2011,108(31): 12740–12745.

[28]Yadav RP,Kotaja N. Small RNAs in spermatogenesis.Mol Cell Endocrinol,2014,382(1): 498–508.

[29]Chuykin I,Stauske M,Guan K. Spermatogonial stem cells.Regenerative Medicine,2013,219–249.

[30]Lewisbp,Shih IH,Jones-Rhoades MW,Bartel DP,Burge CB. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell,2003,115(7): 787–798.

[31]Hayashi K,Chuva de Sousa Lopes SM,Kaneda M,Tang F,Hajkova P,Lao K,O'Carroll D,Das PP,Tarakhovsky A,Miska EA,Surani MA,Heard E. MicroRNA biogenesis is required for mouse primordial germ cell development and spermatogenesis. PLoS ONE,2008,3(3): e1738.

[32]Tong MH,Mitchell D,Evanoff R,Griswold MD. Expression of Mirlet7 family micro RNAs in response to retinoic acid-induced spermatogonial differentiation in mice. Biol Reprod,2011,85(1): 189–197.

[33]Jung YH,Gupta MK,Shin JY,Uhm SJ,Lee HT. Micro-RNA signature in testes-derived male germ-line stem cells.Mol Hum Reprod,2010,16(11): 804–810.

[34]Tong MH,Mitchell DA,McGowan SD,Evanoff R,Griswold MD. Two miRNA clusters,Mir-17–92 (Mirc1) and Mir-106b-25 (Mirc3),are involved in the regulation of spermatogonial differentiation in mice. Biol Reprod,2012,86(3): 72.

[35]Rosa A,Brivanlou AH. A regulatory circuitry comprised of miR-302 and the transcription factors OCT4 and NR2F2 regulates human embryonic stem cell differentiation. EMBO J,2011,30(2): 237–248.

[36]Lichner Z,Pall E,Kerekes A,Pallinger E,Maraghechi P,Bosze Z,Gocza E. The miR-290–295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation,2011,81(1): 11–24.

[37]Zhong X,Li N,Liang S,Huang Q,Coukos G,Zhang L.Identification of microRNAs regulating reprogramming factor LIN28 in embryonic stem cells and cancer cells. J Biol Chem,2010,285(53): 41961–41971.

[38]McIver SC,Roman SD,Nixon B,McLaughlin EA. miRNA and mammalian male germ cells. Hum Reprod Update,2012,18(1): 44–59.

[39]Kimura T,Suzuki A,Fujita Y,Yomogida K,Lomeli H,Asada N,Ikeuchi M,Nagy A,Mak TW,Nakano T.Conditional loss of PTEN leads to testicular teratoma and enhances embryonic germ cell production. Development,2003,130(8): 1691–1700.

[40]Moe-Behrens GH,Klinger FG,Eskild W,Grotmol T,Haugen TB,De Felici M. Akt/PTEN signaling mediates estrogen-dependent proliferation of primordial germ cells in vitro. Mol Endocrinol,2003,17(12): 2630–2638.

[41]Lewisbp,Burge CB,Bartel DP. Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell,2005,120(1):15–20.

[42]Bouhallier F,Allioli N,Lavial F,Chalmel F,Perrard MH,Durand P,Samarut J,Pain B,Rouault JP. Role of miR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis. RNA,2010,16(4): 720–731.

[43]Huszar JM,Payne CJ. MicroRNA 146 (miR146) modulates spermatogonial differentiation by retinoic acid in mice. Biol Reprod,2013,88(1): 15.

[44]Yang QE,Racicot KE,Kaucher AV,Oatley MJ,Oatley JM. MicroRNAs 221 and 222 regulate the undifferentiated state in mammalian male germ cells. Development,2013,140(2): 280–290.

[45]Bao J,Li D,Wang L,Wu J,Hu Y,Wang Z,Chen Y,Cao X,Jiang C,Yan W,Xu C. MicroRNA-449 and micro-RNA-34b/c function redundantly in murine testes by targeting E2F transcription factor-retinoblastoma protein(E2F-pRb) pathway. J Biol Chem,2012,287(26):21686–21698.

[46]Yu Z,Raabe T,Hecht NB. MicroRNA Mirn122a reduces expression of theposttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2 (Tnp2) messenger RNA (mRNA)by mRNA cleavage. Biol Reprod,2005,73(3): 427–433.

[47]Marcon E,Babak T,Chua G,Hughes T,Moens PB.miRNA and piRNA localization in the male mammalian meiotic nucleus. Chromosome Res,2008,16(2): 243–260.

[48]Rajender S,Meador C,Agarwal A. Small RNA in spermatogenesis and male infertility. Front Biosci (Schol Ed),2012,4: 1266–1274.

[49]Ro S,Park C,Sanders KM,McCarrey JR,Yan W. Cloning and expression profiling of testis-expressed microRN As. Dev Biol,2007,311(2): 592–602.

[50]He Z,Jiang J,Kokkinaki M,Tang L,Zeng W,Gallicano I,Dobrinski I,Dym M. MiRNA-20 and mirna-106a regulate spermatogonial stem cell renewal at the post-transcriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1.Stem Cells,2013,31(10): 2205–2217.

[51]Wu JW,Bao JQ,Wang L,Hu YQ,Xu C. MicroRNA-184 downregulates nuclear receptor corepressor 2 in mouse spermatogenesis. BMC Dev Biol,2011,11: 64.

[52]王虹,騰鴻琦,施玨平,張彥定,張明鳳. Let-7 micro-RNA調(diào)控動物器官發(fā)育的研究進展. 生命科學,2011,23(4): 364–368.

[53]Piskounova E,Viswanathan SR,Janas M,LaPierre RJ,Daley GQ,Sliz P,Gregory RI. Determinants of micro-RNA processing inhibition by the developmentally regulated RNA-binding protein Lin28. J Biol Chem,2008,283(31): 21310–21314.