過表達(dá)CD82對植入期小鼠子宮內(nèi)膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表達(dá)的影響

尉曉蔚，譚冬梅，張倩，何通川，譚毅

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院,大連 116001;2.重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,重慶 400016; 3.美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實驗室)

研究報告

過表達(dá)CD82對植入期小鼠子宮內(nèi)膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表達(dá)的影響

尉曉蔚1，譚冬梅2，張倩2，何通川3，譚毅2

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院,大連 116001;2.重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,重慶 400016; 3.美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實驗室)

目的探討CD82對著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)整合素αV、β3、E-cadherin以及β-catenin蛋白表達(dá)的影響。方法將構(gòu)建的CD82腺病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。檢測妊娠小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD82腺病毒后,細(xì)胞內(nèi)整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)變化情況。結(jié)果提取的上皮細(xì)胞純度為(93.2±0.6)%。構(gòu)建的CD82腺病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)到 (92.0±4.5)%,轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h后,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CD82基因表達(dá)明顯升高。轉(zhuǎn)染48 h后,Western blot檢測CD82蛋白水平明顯升高。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測妊娠第4天的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD82腺病毒后,整合素αV、β3以及β-catenin的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組均有明顯上升(P＜0.05),但E-cadherin的表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論 胚胎植入前, CD82可能影響小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)整合素αV、β3和β-catenin的蛋白表達(dá)。

CD82基因;重組腺病毒;子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞;原代培養(yǎng);孕小鼠

【Key words】CD82 gene;Recombinant adenovirus;Uterine epithelial cells;Primary cell culture;Pregnantmice

胚胎著床是生殖的關(guān)鍵步驟,包括胚胎與子宮內(nèi)膜的識別,黏附以及植入［1］。首先,胚胎定位并黏附到接受態(tài)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面,隨后胚胎穿透子宮內(nèi)膜表面,植入子宮內(nèi)膜基質(zhì)中,完成植入。子宮內(nèi)膜從非接受態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軕B(tài)時,不僅形態(tài)發(fā)生變化,其表面還表達(dá)許多黏附分子及黏附相關(guān)分子,有利于胚胎著床的進行［2］。

CD82糖蛋白屬于四次跨膜糖蛋白,在腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷愈合、胚胎著床等過程中發(fā)揮重要作用［3］。CD82作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子,在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌以及宮頸癌等多種癌癥中的表達(dá)明顯降低甚至缺失,其機制可能是由于 CD82可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移［4］。Gellersen等［5］發(fā)現(xiàn)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞不表達(dá)CD82,但是母胎界面的蛻膜細(xì)胞大量表達(dá)CD82,提示CD82可能參與胚胎植入。我們的前期研究結(jié)果表明,CD82在小鼠動情周期、早孕及假孕的子宮內(nèi)膜中均有規(guī)律表達(dá)［6,7］。胚胎植入的前提是胚胎與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間的相互黏附,然而CD82是否參與該黏附過程尚無報道。本實驗室構(gòu)建CD82腺病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。觀察CD82蛋白高表達(dá)時,與黏附相關(guān)的整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin四個因子的蛋白表達(dá)變化情況,從而尋找CD82在胚胎植入可能參與的信號通路和相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

兔抗小鼠CD82抗體、小鼠抗小鼠角蛋白抗體、山羊抗小鼠波形蛋白抗體、兔抗小鼠integrinαV抗體、山羊抗小鼠integrinβ3抗體、兔抗小鼠E-cadherin抗體、山羊抗小鼠β-catenin抗體均購自美國Santa Cruz公司。生物素化兔二抗、山羊二抗、小鼠二抗、鏈霉素親和素-過氧化物酶復(fù)合物以及DAB顯色試劑盒等均購自中國北京中山生物技術(shù)有限公司。293細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。胎牛血清購自美國GIBCO生物公司。Trypsin購自美國Sigma公司。

1.1.2 實驗動物

SPF級KM小鼠,6周齡,雌性,體重18～20 g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［SCXK(渝)2007 -0001］。無菌手術(shù)在重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障動物實驗設(shè)施進行［SYXK(渝)2007-0001］。所有實驗操作程序均經(jīng)過重慶醫(yī)科大學(xué)動物使用管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

將妊娠第4天的雌鼠分別處死后取子宮,去除子宮周圍的結(jié)締組織和脂肪。用PBS清洗子宮并將其縱向切開,內(nèi)膜面朝上展平于培養(yǎng)皿中,加0.5%trypsin靜置2 h(4℃)和0.5 h(37℃)。之后,將子宮組織移入15mL離心管內(nèi),反復(fù)吸打后棄去子宮組織,溶液經(jīng)1000 r/min離心10 min后棄去上清液;底層的細(xì)胞懸液再加入含10%血清的培養(yǎng)基反復(fù)清洗2次后,以1×106/mL濃度接種到6孔板內(nèi),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組CD82腺病毒的擴增和提取

本實驗室已經(jīng)成功構(gòu)建含小鼠CD82全基因的重組腺病毒［8］。當(dāng)293細(xì)胞至80%融合時,轉(zhuǎn)染腺病毒原液。每0.4μL病毒原液(6.5×1012pfu/mL)轉(zhuǎn)染5×105細(xì)胞。在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),約48 h后熒光顯微鏡下觀察RFP表達(dá)情況,此時約90%的293細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光,且部分細(xì)胞漂起。將293細(xì)胞輕輕吹打下來,1000 r/min,離心5 min棄上清液,用150μL PBS重懸,收集細(xì)胞并反復(fù)凍融提取病毒液。將所提取的病毒液再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,以大量制備病毒液。

1.2.3 重組CD82腺病毒的病毒滴度測定

將多次轉(zhuǎn)染制備的病毒液做不同比例稀釋(1∶104～1∶1012),將400μL稀釋液加至293細(xì)胞培養(yǎng)板(24孔板)中,37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)l8～24 h于熒光顯微鏡下計數(shù)RFP陽性細(xì)胞數(shù)。選擇能轉(zhuǎn)染的最高稀釋倍數(shù)孔內(nèi)細(xì)胞(有熒光)。按下列公式計算病毒滴度:病毒滴度=RFP陽性細(xì)胞數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)(pfu/mL)/0.4 mL。

1.2.4 CD82腺病毒轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞

妊娠4d的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,接種于10%多聚賴氨酸包被的小玻片上,24 h后轉(zhuǎn)染擴增的CD82腺病毒。轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 RT-PCR

轉(zhuǎn)染24 h后,Trizol試劑制備總RNA,具體操作按試劑操作說明書進行。經(jīng)A260/A280的比值和電泳檢測結(jié)果檢測RNA的純度,并計算RNA含量(RNAμg/mL=A 260×40×稀釋倍數(shù)),所得樣品置于-80℃保存。兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。CD82上游引物為上游引物:5’-CAT AGA TCT ACC ATG GGG GCA GGC TGT GT-3’。下游引物為5’-TCA GTC GAC TCA GTA CTT GGG GAC CTT GC-3’。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s, 55℃退火30 s,72℃延伸30 s,擴增28個循環(huán),72℃延伸10 min。

1.2.6 Western blot

轉(zhuǎn)染48 h后,在冰上刮取貼壁生長的上皮細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞全蛋白。取50μg細(xì)胞全蛋白,進行12%SDS-PAGE電泳,之后轉(zhuǎn)PVDF膜,一抗?jié)舛?∶500,二抗?jié)舛?∶1500。HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法檢測CD82蛋白水平。

1.2.7 免疫細(xì)胞化學(xué)

將原代提取到的上皮細(xì)胞,爬片于10%多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片上。妊娠第4天的上皮細(xì)胞,待其單層形成后取出玻片;轉(zhuǎn)染腺病毒的妊娠第4天的上皮細(xì)胞,取80μL CD82腺病毒,轉(zhuǎn)染48 h后取出玻片。各組均按免疫細(xì)胞化學(xué)常規(guī)步驟進行操作。各種多克隆抗體按1∶200稀釋,以PBS代替一抗作為陰性對照。試劑公司提供的陽性對照照片作為陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每個實驗重復(fù)3次,結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。免疫組織化學(xué)使用Image-Pro Plus 6.0經(jīng)軟件進行分析。Lab works 4.60軟件進行分析處理,以內(nèi)參基因GAPDH為基準(zhǔn)分析各條帶的相對密度值。免疫細(xì)胞化學(xué)隨機選擇5個高倍視野觀察細(xì)胞有無棕黃染色,根據(jù)染色強度及范圍分別計分。累計0～1分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),2～3分為陽性(++),3～4分為強陽性(+++)。結(jié)果是每張片子隨機選擇的5個高倍視野的平均值。組間差異使用SPASS 13.0軟件中的單因素方差分析以及t檢驗。以P＜0.05為差異有顯著性,P＜0.01為差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的純度鑒定

原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列緊密,分界不清,細(xì)胞核大而圓,位于細(xì)胞中央?？拷渲醒氲纳掀ぜ?xì)胞較小,呈不規(guī)則形或多邊形;位于集落外周的細(xì)胞,胞體較大,呈立方形或短柱狀,有些細(xì)胞還圍成腺體形態(tài)。采用上皮細(xì)胞特異的角蛋白抗體以及基質(zhì)細(xì)胞特異的波形蛋白抗體對細(xì)胞進行免疫化學(xué)染色。角蛋白的陽性染色為棕色,主要分布在胞質(zhì)區(qū)域(圖1A);陰性對照組的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域均無陽性反應(yīng)(圖1 B)。波形蛋白抗體組的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域均無陽性反應(yīng)(圖1 C);顯微鏡下隨機選擇不同的區(qū)域,計數(shù)不同區(qū)域內(nèi)免疫染色陽性的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),然后計算其比值。統(tǒng)計結(jié)果顯示,提取的上皮細(xì)胞純度為(93.2±0.6)%。(圖1見彩插11)。

2.2 重組CD82腺病毒的病毒滴度測定

以不同稀釋度的重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察RFP的表達(dá)(圖2),見1∶105和1∶106稀釋孔內(nèi)有較多細(xì)胞內(nèi)有熒光,1∶104稀釋孔內(nèi)幾乎全部細(xì)胞內(nèi)有熒光。而1∶107至1∶109RFP表達(dá)的細(xì)胞逐漸減少。測得腺病毒轉(zhuǎn)染滴度為2.2 ×108pfu/mL。

2.3 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞CD82基因和蛋白的表達(dá)

重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞48 h后,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到(92.0± 4.5)%(圖2,彩插11)。RT-PCR和Western blot檢測CD82基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組CD82腺病毒組較對照組有明顯的升高(圖3)。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,CD82蛋白表達(dá)于妊娠第4天的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。轉(zhuǎn)染CD82腺病毒后,上皮細(xì)胞強陽性表達(dá)CD82蛋白,部分細(xì)胞的CD82蛋白甚至異位表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi);整合素αV、β3和E-cadherin表達(dá)于妊娠第4天的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì);β-catenin蛋白表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì);與空腺病毒組比較,轉(zhuǎn)染CD82腺病毒的上皮細(xì)胞,整合素αV、β3和βcatenin表達(dá)明顯上升(P＜0.05),E-cadherin的表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05)。各蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的表達(dá)見圖4(彩插12)。

3 討論

CD82廣泛表達(dá)于各個組織中［9］。CD82的表達(dá)變化與不同的生理和病理過程相關(guān)。例如,CD82表達(dá)水平的下降與子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌以及卵巢癌等多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)［10］。CD82的增加與增強細(xì)胞黏附密切相關(guān)［11］。本實驗室前期研究結(jié)果表明CD82在小鼠動情周期、早孕及假孕子宮內(nèi)膜中均有規(guī)律表達(dá)［6,7］。另外,CD82與DARC的相互作用抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［12］,暗示我們CD82可能在母胎界面發(fā)揮黏附分子的作用。已有報道發(fā)現(xiàn),CD82與其他TM4SF蛋白,或與整合素、E-cadherin結(jié)合,在細(xì)胞表面形成復(fù)合物,介導(dǎo)同型或異型細(xì)胞間的粘附,從而抑制腫瘤細(xì)胞的運動和侵襲能力［13,14］。

注:A:轉(zhuǎn)染CD82腺病毒24 h后,RT-PCR檢測CD82基因的表達(dá);B:轉(zhuǎn)染CD82腺病毒48 h后,Western blot檢測CD82蛋白的表達(dá)。P組:妊娠第4天的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞;P +Ad組:轉(zhuǎn)染空腺病毒組;P+Ad-CD82組:轉(zhuǎn)染CD82腺病毒組。圖3 CD82轉(zhuǎn)染小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后CD82基因和蛋白的表達(dá)Note:A:RT-PCR analysis of expression of CD82mRNA at24 h after CD82 adenovirus transfection;B:Western blot detection of CD82 protein at48 h after CD82 adenovirus transfection.Pregnant group:primary cultured uterine epithelial cells on day 4;P +Ad group:transfection with control adenovirus;P+Ad-CD82 group:transfection with CD82 adenovirus.Fig．3 Expression of CD82 in the mouse uterine epithelial cells after CD82 adenovirus transfection.

處于接受態(tài)的子宮內(nèi)膜,其上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一系列有利于胚胎植入的超微結(jié)構(gòu)的變化［15］。此外,在著床窗口期的子宮內(nèi)膜上,許多分子表達(dá)水平的變化與其接受態(tài)的建立相關(guān)。黏附相關(guān)分子,例如粘蛋白和整合素,在著床窗口期的表達(dá)明顯升高,參與子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立［16,17］。αVβ3在子宮內(nèi)膜上皮周期特征性表達(dá),窗口期整合素αVβ3等表達(dá)水平的增高,與內(nèi)膜“著床窗”開放的時間相吻合,可作為子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志［18,19］。Ruseva等［20］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CD82可以顯著增加整合素αVβ3/玻璃粘連蛋白-依賴的卵巢癌細(xì)胞的黏附。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD82高表達(dá)可以明顯增加整合素αV和β3的蛋白表達(dá),提示我們CD82可能是整合素αV和β3的上游調(diào)控因子。

E-cadherin介導(dǎo)細(xì)胞間相互聚集。E-cadherin與β-catenin形成復(fù)合物后,在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架的微絲系統(tǒng)相連。如果不能形成E-cad/β-cat復(fù)合物,將導(dǎo)致上皮細(xì)胞之間的粘附力的下降或喪失。我們前期研究發(fā)現(xiàn),CD82在胚胎卵裂時可能與E-鈣黏素等細(xì)胞粘附分子結(jié)合,促進了胚胎的致密化,從而促進胚胎發(fā)育至囊胚［21］。本實驗免疫細(xì)胞化學(xué)顯示,轉(zhuǎn)染CD82腺病毒組和空腺病毒組,其E-cadherin表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異,說明CD82不能改變細(xì)胞水平的E-cadherin,也不能改變E-cadherin的定位。但是轉(zhuǎn)染CD82腺病毒后,β-catenin蛋白出現(xiàn)明顯的上調(diào)。推測CD82可能通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)在E-cad/β-cat復(fù)合物中發(fā)揮作用。

總之,我們認(rèn)為胚胎植入前,小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)整合素αV、β3和β-catenin的表達(dá)可能受CD82的影響,為進一步研究CD82基因在胚胎著床中的作用奠定了基礎(chǔ)。

(本文圖1，2見彩插11，圖4見彩插12。)

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Effect of CD82 on the expression of integrinαV,β3,E-cadherin and β-catenin in uterine epithelial cells in pregnantm ice

WEIXiao-Wei1,TAN Dong-Mei2,ZHANG Qian2,HE Tong-Chuan3,TAN Yi2*
(1.Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China; 2.Chongqing Medical University,Chongqing 400016;3.Molecular Tumor Laboratory,Chicago University)

ObjectiveUterine epithelial cellswere isolated from pregnantmice and cultured in vitro,and examined the effect of CD82 on the expression of integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin in the cells.M ethodsThe uterine epithelial cellswere primarily isolated from pregnantmouse uterus.The recombinantadenovirus containingmouse CD82 gene which had been constructed in our lab infected the uterine epithelial cells.Immunocytochemistry was used to detect the protein expressions of integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin in the uterine epithelial cells,which were infected with CD82 adenovirus or not.Results1.The purity of primary cultured cellswas(93.2±0.6)%.2.The transfection efficiency of CD82 recombinant adenovirus was(92±4.5)%.The adenoviral particles carrying CD82 gene indeed expressed CD82 gene and protein in the primary uterine epithelial cells after 24 hours or 48 hours.3.The uterine epithelial cells of pregnantmice on d4 expressed integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin.4.In contrast to the control group, when CD82 adenovirus infected cells,the uterine epithelial cells of pregnantmice on d4 increased the expression of integrin αV,β3 andβ-catenin protein,had no significant changes of E-cadherin.ConclusionsCD82 may have effect on the expression of integrinαV,β3 andβ-catenin inmouse uterine epithelial cells before implantation.

Q95-33,Q492

A

1005-4847(2014)03-0057-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.012

2014-01-20

國家自然科學(xué)基金(30470654);重慶市自然科學(xué)基金(2009BB5409);教育部博士點科研基金(20095503110006)。

尉曉蔚(1983年-),女,助理研究員。研究方向:胚胎著床的分子機制。E-mail:angelwei2003@163.com

譚毅(1966年-),男,教授,研究員。研究方向:胚胎著床和實驗動物學(xué)。E-mail: tanyee66@hotmail.com