膽總管內(nèi)注射無水乙醇致膽道閉鎖動物模型的建立

葛軍濤，李龍，魏延棟，王海斌，喬國梁，張震，劉垚，明安曉

(首都兒科研究所,北京 100020)

研究報告

膽總管內(nèi)注射無水乙醇致膽道閉鎖動物模型的建立

葛軍濤，李龍，魏延棟，王海斌，喬國梁，張震，劉垚，明安曉

(首都兒科研究所,北京 100020)

目的應(yīng)用膽總管內(nèi)注射無水乙醇建立SD大鼠膽道閉鎖模型。方法將SD雄性大鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組,在實驗組中經(jīng)靜脈留置針插入膽總管注入無水乙醇,對照組注入生理鹽水。觀察SD大鼠的生化及病理結(jié)果。結(jié)果在實驗組中SD大鼠根據(jù)病理及生化檢測分為肝功能持續(xù)惡化組和肝功能修復(fù)組,肝功能持續(xù)惡化組在8周以后生化明顯高于對照組及肝功能修復(fù)組。常規(guī)HE染色及SMA、Masson染色也出現(xiàn)明顯變化。結(jié)論膽總管無水乙醇注射誘導(dǎo)膽道閉鎖模型是一種可靠的動物模型,此動物模型會幫助人們進(jìn)一步研究膽道閉鎖提供更多的研究手段。

膽道閉鎖;肝硬化;無水乙醇;大鼠模型

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是以肝內(nèi)外膽管閉鎖和梗阻性黃疸為特點的小兒外科常見畸形,其病因和發(fā)病機(jī)制未明使得臨床研究也受到極大限制。盡管膽道閉鎖患兒成功的進(jìn)行手術(shù)治療伴隨而來的還會有慢性肝臟疾病以至于大部分患兒必須接受肝移植。文獻(xiàn)報道［1］葛西手術(shù)和肝移植的聯(lián)合應(yīng)用可以使患兒的十年生存達(dá)到90%。但是50多年來人們在探索膽道閉鎖的動物模型中所獲得的單一臨床應(yīng)用少之又少。1957年開始,Symeonidis［2］就通過結(jié)扎成年大鼠的膽總管來建立動物膽道閉鎖模型,后來Dumont［3］通過膽總管注射福爾馬林來誘導(dǎo)膽管炎,最近獼猴輪狀病毒［4-6］致膽道閉鎖的模型讓研究者們收到極大鼓舞,成為最近普遍被接受的一種動物模型。但是種種動物模型并沒有完全的模擬膽道閉鎖臨床上的表現(xiàn),所以我們建立了SD大鼠膽總管內(nèi)無水乙醇注射模型來模擬膽道閉鎖并與膽道閉鎖臨床表現(xiàn)進(jìn)行了對比。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD雄性大鼠,24只,體重150～170 g,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK(軍)2009-0011】。其中16只作為實驗組從膽總管注入無水乙醇,8只作為對照組膽總管內(nèi)注入生理鹽水。所有大鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部【SYXK(京)2011-0039】,室溫(22± 2)℃;濕度50%～70%,自由進(jìn)食、飲水。術(shù)前當(dāng)晚禁食。術(shù)后相同條件下飼養(yǎng),明暗周期各12 h。

1.2 手術(shù)方法

大鼠采用l%戊巴比妥鈉(10μL/g)腹腔麻醉后,取仰臥位,固定四肢后置于手術(shù)臺,沿劍突及左右肋緣分層切開皮膚,找到肝十二指腸韌帶,在顯微鏡下分離膽總管,用2條6-0手術(shù)線提起膽總管然后插入密閉式靜脈留置針(留置針直徑0.7 mm,長度19mm)然后拔出針芯觀察是否有膽汁流出,有膽汁流出證明在膽總管內(nèi),留置針頭端達(dá)到尾狀葉水平然后將手術(shù)線打結(jié)固定,通過微量調(diào)節(jié)注射器注入無水乙醇或生理鹽水(無水乙醇的注射劑量:基于大鼠注入0.18 mL黑墨水于肝臟后,可以在肝臟表面看到黑色顆粒,故根據(jù)大鼠體重計算劑量為1.2μL/g。自實驗起觀察8周安樂死動物)。隨后保持無水乙醇或生理鹽水于肝內(nèi)5 min后拔下微量調(diào)節(jié)注射器使液體自然流出。靜脈留置管遠(yuǎn)端切斷插入空腸(距離Treitz韌帶3 cm),并且用11-0尼龍線縫合固定(如圖1)。結(jié)扎膽總管遠(yuǎn)端并切斷膽總管。實驗完成后動物禁食一天后給予食物和水。

1.3 觀察指標(biāo)

分別在0、2、4、6、8周尾部取血,取血量為1 mL。然后放入離心機(jī)3500 r/min離心5min,取上層血漿測總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.4 病理

取肝臟同一葉(左后葉)組織放入4%甲醛中固定,然后石蠟包埋作連續(xù)切片并行HE染色、Masson染色、SMA染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。觀察比較實驗組與對照組肝臟外形以及肝臟組織常規(guī)切片,HE染色在顯微鏡下觀察肝內(nèi)外膽管管腔有無狹窄、閉塞,膽管周圍有無明顯炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞有無變性壞死,肝細(xì)胞內(nèi)有無淤膽,以及肝臟有無炎性細(xì)胞浸潤。Masson染色觀察纖維化以及SMA染色觀察匯管區(qū)動、靜脈及膽管平滑肌變化。

注:在胰膽管匯合點以上切開膽總管,用2條6-0手術(shù)線提起膽總管然后插入密閉式靜脈留置針(0.7 mm×19 mm),留置針頭端達(dá)到尾狀葉水平時雙重結(jié)扎。膽總管遠(yuǎn)端結(jié)扎并切斷,靜脈留置針遠(yuǎn)端切斷并放入空腸內(nèi)固定。圖1 手術(shù)方法Note:To cut the common bile duct above the pancreatic duct confluence,with two6-0 surgical thread to lift the duct,and then insert the closed intravenous catheter(0.7 mm×19mm).The end of the catheter needle is placed to the caudate lobe levelwith double ligation.The distal common bile duct is ligated and cut.The distal intravenous catheter is cut and fixed in the jejunum.Fig．1 Describtion of the surgical procedure

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 動物手術(shù)后表現(xiàn)

實驗組中的5只大鼠(31.25%)和對照組中的6只大鼠(75%)存活到術(shù)后8周,通過解剖發(fā)現(xiàn)實驗組中大鼠可能死于術(shù)后禁食時間過短,因為發(fā)現(xiàn)胃部有大量食物堆積而腸道內(nèi)空虛。實驗組中大鼠死亡原因除了死于禁食時間過短外,發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的肝硬化腹水和營養(yǎng)不良。同時我們通過病理發(fā)現(xiàn)在實驗組中同樣存在兩種病理變化。通過大鼠生化檢測結(jié)果觀察到實驗組的生化結(jié)果也存在很大差異,有一類實驗組大鼠總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶呈進(jìn)行性加重,我們暫且稱之為持續(xù)損傷組(膽道閉鎖模型);另一組大鼠總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶在術(shù)后升高后又慢慢恢復(fù)到正常值范圍,我們暫且稱之為恢復(fù)組。

2.2 肝臟生化及病理染色

持續(xù)損傷組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶如圖2。持續(xù)損傷組相對應(yīng)的病理變化如圖3?；謴?fù)組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶如圖4。恢復(fù)組相對應(yīng)的病理變化如圖5(圖2、3見彩插7,圖4,5見彩插8)。

2.3 術(shù)后解剖所見

持續(xù)組肝臟損傷表面可見明顯的結(jié)節(jié),腹腔內(nèi)可見明顯的大量腹水以及明顯的曲張靜脈叢,說明持續(xù)損傷組大鼠發(fā)生明顯的肝硬化及門脈高壓。如圖6(彩插8)。

3 討論

膽道閉鎖臨床表現(xiàn)為阻塞性黃疸,陶土樣大便和肝脾腫大三聯(lián)癥,基本的病理變化為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥和肝纖維化,此種疾病無論是對于病人及其家庭、就診醫(yī)生、社會來講都是一種悲劇［7］,盡管患兒成功的進(jìn)行葛西手術(shù),但大部分患兒最后不得不進(jìn)行肝移植手術(shù)以及面對肝移植后的器官排斥和其他繼發(fā)病。幾種動物模型前面已經(jīng)介紹過,膽總管切除模型會導(dǎo)致近端的膽總管明顯擴(kuò)張,導(dǎo)致動物在術(shù)后4周死亡。相反,膽總管結(jié)扎模型會導(dǎo)致膽管的再通,肝臟的功能和形態(tài)可以恢復(fù)正常。在膽總管內(nèi)注射甲醛誘導(dǎo)硬化性膽管炎的動物模型中,肝臟的組織學(xué)檢查顯示膽管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤以及小膽管的纖維性膽管炎和增生,但是匯管區(qū)周圍的肝細(xì)胞是正常的。在獼猴輪狀病毒感染小鼠模擬膽道閉鎖的模型中,小鼠肝臟顏色淡黃至深黃,部分肝緣呈鮮黃色壞死樣,肝包膜緊張,表面顆粒狀,質(zhì)韌,膽囊萎縮或膨大,肝外膽道呈條索狀狹窄和閉鎖。HE染色顯示肝內(nèi)匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤,淤膽明顯,部分肝緣組織出現(xiàn)點灶樣或大塊壞死;肝外膽管連續(xù)切片見膽管狹窄和閉鎖,膽管壁增厚,膽管內(nèi)皮細(xì)胞不規(guī)則增生,伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤,有時候會發(fā)現(xiàn)肝外膽道閉鎖近端的膨大。但是肝內(nèi)膽管變化比較輕微,更深層次的研究發(fā)現(xiàn)動物模型中的小鼠并沒有像人一樣出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟纖維化和門脈高壓。小鼠的病毒模型至少是對病毒學(xué)說的一種支持,因為注射病毒的新生小鼠發(fā)生了膽道的梗阻。但Coots等［8］在最近的研究中發(fā)現(xiàn)人類的膽管上皮和小鼠的膽管上皮一樣對獼猴輪狀病毒敏感,這種發(fā)現(xiàn)表明在人類的膽道閉鎖疾病病因中獼猴輪狀病毒或許起著很大的潛在性作用。

在目前的酒精模型中,持續(xù)損傷組中的大鼠發(fā)生了肝臟的損傷并且導(dǎo)致硬化性的膽管炎。在這些動物中雖然肝外膽道在顯微鏡下并沒有閉鎖但是肝內(nèi)膽道病理變化特點和膽道閉鎖非常類似。Kyokane等［9］在2001年做過選擇性的肝葉(大約肝重70%)注射無水乙醇,劑量約為0.6μL/g。結(jié)果顯示術(shù)后第14天注射部分肝葉重量減少到整個肝重的50%,而未注射部分肝葉重量增加1.6倍,膽汁流量和膽汁酸明顯增加。組織結(jié)構(gòu)上注射無水乙醇肝葉部分肝內(nèi)膽管被破壞并且發(fā)生纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤,最終導(dǎo)致肝內(nèi)膽管閉鎖但不壞死。血清轉(zhuǎn)氨酶在術(shù)后第14天時回到正常范圍。所以在目前的無水乙醇模型中,我們認(rèn)為恢復(fù)組有可能由于無水乙醇的量不足引起的,換句話說在無水乙醇注射過程中可能發(fā)生了酒精的泄漏。即使無水乙醇的量充足,但是大鼠間先天性的膽管直徑以及注射速度和對無水乙醇的反應(yīng)也存在差異。

我們認(rèn)為此動物模型基于無水乙醇膽總管注射引起膽管上皮損傷,導(dǎo)致硬化性膽管炎及其他繼發(fā)反應(yīng),繼發(fā)反應(yīng)通過引起膽管的破壞和纖維組織的替代發(fā)生肝內(nèi)膽管的堵塞同時伴隨膽管的增生。總之,此大鼠的酒精模型與臨床上膽道閉鎖模型非常類似,所以,此模型對于研究膽道閉鎖有進(jìn)一步的幫助。

(本文圖2～6見彩插7，8)。

［1］ Hartley JL,Davenport M,Kelly DA.Biliary atresia［J］.Lancet,2009.374(9702):1704-1713.

［2］ Symeonidis A.Trams EG.Morphologic and functional changes in the livers of rats after ligation or excision of the common bile duct［J］.Am JPathol,1957.33(1):13-27.

［3］ Dumont M,D’Hont C,Moreau A,et al.Retrograde injections of formaldehyde into the biliary tree induce alterations of biliary epithelial function in rats［J］.Hepatology,1996.24(5):1217 -1223.

［4］ Petersen C,Biermanns D,Kuske M,et al.New aspects in a murinemodel for extrahepatic biliary atresia［J］.JPediatr Surg, 1997.32(8):1190-1195.

［5］ Petersen C,Kuske M,Bruns E,et al.Progress in developing animalmodels for biliary atresia［J］.Eur JPediatr Surg,1998. 8(3):137-141.

［6］ Allen SR,Jafri M,Donnelly B,et al.Effect of rotavirus strain on themurinemodel of biliary atresia［J］.J Virol,2007.81 (4):1671-1679.

［7］ Petersen C.Biliary atresia:the animalmodels［J］.Semin Pediatr Surg,2012.21(3):185-191.

［8］ Coots A,Donnelly B,Mohanty SK,et al.Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels themurinemodel of biliary atresia［J］.JSurg Res,2012.177(2):275-281.

［9］ Kyokane T,Nagino M,Oda K,et al.An experimental study of selective intrahepatic biliary ablation with ethanol［J］.JSurg Res,2001.96(2)188-196.

Injection of ethanol into the common bile duct to establish a rat model of biliary atresia

GE Jun-tao,LILong,WEIYan-dong,WANG Hai-bin,QIAO Guo-liang,ZHANG Zhen,LIU Yao,MING An-xiao
(Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish a new ratmodel of biliary atresia by pure ethanol injection into the common bile duct.MethodsA catheterwas inserted and fixed in the common bile duct inmale SD rats.Saline(8 rats)or pure ethanol(16 rats)was injected through the catheter,respectively,and the biochemical and pathological changes in the rats were examined.ResultsSD rats in the experimental group were divided into a persistent injury and a restoration of liver dysfunction groups according to pathological and biochemical detection.In the persistent injury group,biochemical impairmentswere significantly higher at8 weeks after ethanol injection than those in the control group and restoration group.Distinct pathological changes in the liver were observed using HE,SMA,and Masson staining.ConclusionsIt is a reliable animalmodel of biliary atresia induced by injection of pure ethanol into the common bile duct in the rat.It will provide a useful tool in future studies of biliary atresia.

Biliary atresia;Liver cirrhosis;Pure ethanol;Rat,model

Q95-33

A

1005-4847(2014)03-0050-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.010

2014-03-13

國家自然科學(xué)基金面上項目,先天性膽道畸形肝臟損傷及修復(fù)機(jī)制研究(81170335)。

葛軍濤(1986年-),男,在讀碩士生。E-mail:gejuntao0620@163.com

李龍。E-mail: lilong23@126.com