兩種非甾體類抗炎藥對清醒狀態(tài)血管源性頭痛模型大鼠顱內(nèi)Fos表達(dá)的影響

王曉輝，朱浩靜，王恒，孫宇，吳士文，于生元

(1.武警總醫(yī)院,北京 100039;2.解放軍總醫(yī)院,北京 100853)

研究報告

兩種非甾體類抗炎藥對清醒狀態(tài)血管源性頭痛模型大鼠顱內(nèi)Fos表達(dá)的影響

王曉輝1，朱浩靜1，王恒1，孫宇1，吳士文1，于生元2

(1.武警總醫(yī)院,北京 100039;2.解放軍總醫(yī)院,北京 100853)

目的通過觀察血管源性頭痛清醒動物模型中Fos陽性細(xì)胞在三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核的分布情況,明確兩種非甾體類抗炎藥NSAID對乙酰氨基酚及布洛芬在頭痛控制中,在顱內(nèi)特定區(qū)域的作用機(jī)理。方法 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組(生理鹽水組)、對乙酰氨基酚組、布洛芬組,每組給藥后50 min分別給予頻率為20 Hz、電流為3～5 mA和脈寬為0.25 ms的電刺激,刺激后給予大鼠灌注固定取腦,分別在顱內(nèi)取三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核制作石蠟切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,利用Image J軟件對陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。結(jié)果電刺激后鹽水組與非甾體類藥物組在雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核Fos蛋白表達(dá)的差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,對乙酰氨基酚組與布洛芬組在雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核Fos蛋白表達(dá)未見統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論給予非甾體類抗炎前后在雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核的Fos表達(dá)的改變提示三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核參與了疼痛的傳遞和表達(dá)以及藥物對疼痛控制的藥理過程。

偏頭痛;非甾體類抗炎藥;對乙酰氨基酚;布洛芬;Fos蛋白

偏頭痛是一種常見的原發(fā)性頭痛,屬于血管源性頭痛,為一種發(fā)作性疾病,其臨床特點(diǎn)為頭部單側(cè)或雙側(cè)搏動性疼痛,發(fā)作時常伴有惡心、嘔吐,畏光、畏聲等伴隨癥狀。據(jù)WHO調(diào)查研究所示,偏頭痛全球患病率達(dá)10%,終生患病率為14%［1］。我國于2008～2009年最新的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,偏頭痛的年患病率為9.3%,其中對生活及工作造成中重度影響的偏頭痛患者比例高達(dá)38%,全年帶來的社會經(jīng)濟(jì)總損失高達(dá)3317億元人民幣,占GDP總額1.12%［2］。WHO把偏頭痛列為最能使勞動能力下降的疾病之一［1］,頭痛被列為致殘率最高的十大疾病之一［3］,嚴(yán)重影響患者的工作能力及生活質(zhì)量,給社會與家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。非甾體類抗炎解熱鎮(zhèn)痛劑在臨床上已得到廣泛應(yīng)用,對乙酰氨基酚屬乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛劑,布洛芬屬丙酸類抗炎鎮(zhèn)痛劑,二者均通過抑制中樞及外周前列腺素合成發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用［4］。本研究應(yīng)用清醒狀態(tài)下電刺激大鼠上矢狀竇硬腦膜的動物模型,分別在鹽水組及非甾體類抗炎藥物組觀察模型大鼠顱內(nèi)雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核的Fos陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)及變化情況,同時明確兩種藥物對疼痛控制的藥理過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級雄性SD大鼠30只,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心［SCXK(軍)2012 -0004］,分為對照組(A組)、對乙酰氨基酚組(B組)、布洛芬組(C組),每組10只,體重在250～350g之間,在解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗中心實(shí)驗室無特定病原體(specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間【SYXK(軍)2011-002】飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 動物模型建立方法

實(shí)驗大鼠用10%的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉,于大鼠頭正中部備皮,充分暴露頭皮,固定于立體定位儀上,以手術(shù)切口為中心,直徑約2 cm區(qū)域,常規(guī)碘伏消毒術(shù)野周圍皮膚,逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉,充分暴露顱骨,以顱中線與冠狀縫交叉點(diǎn)前4 mm為前界,后6 mm為后界,用臺式牙科鉆分別鉆開兩個直徑為1 mm的圓孔至上矢狀竇硬腦膜,并充分使其暴露,將其作為刺激孔,鉆孔過程中間斷給予生理鹽水沖洗降溫,防止硬腦膜灼傷,整個過程中切勿損傷硬腦膜,將制作好的金屬電極(由2根直徑約1mm的金屬導(dǎo)線組成正負(fù)極,僅最前端可導(dǎo)電,其他金屬部分均涂抹絕緣材料,兩電極相距9 mm,末端接連接插頭,將于刺激時與刺激器和分離器相連接)的兩端,將電極2個接頭即正負(fù)極分別放入前述鉆孔內(nèi),使兩端導(dǎo)電處充分與硬腦膜接觸,同時用502膠及牙托粉和義齒基托樹脂(即牙托水)逐步將電極與顱骨充分固定,縫合頭皮皮膚,避免觸碰點(diǎn)擊,電極接線口留置于頭皮外側(cè),術(shù)后即可給予青霉素40萬U/kg腹腔注射預(yù)防感染,術(shù)后單籠飼養(yǎng)3d,第4天給予電刺激。

1.2.2 電刺激方法

應(yīng)用日本光電工業(yè)株式會社生產(chǎn)的刺激器(型號:SEN-7103,日本)和分離器(型號:SS-102J,日本)進(jìn)行電刺激,每組大鼠均給予電刺激2次,參數(shù)為頻率20 Hz、輸出電流3～5 mA、刺激脈寬為0.25 ms,刺激時間為300 s,其中A組給藥為生理鹽水1.5 mL,B組給予對乙酰氨基酚(45 mg/kg,上海施貴寶制藥,中國),C組給予布洛芬混懸液(27 mg/ kg,上海強(qiáng)生制藥,中國),B、C組均將藥物溶于1.5mL生理鹽水。

1.2.3 免疫組化方法

各組均分別進(jìn)行灌注固定:麻醉后用外科剪于胸部正中逐層分離皮膚,暴露心臟,于左心室處剪開小口,由此插細(xì)導(dǎo)管至升主動脈,先用300mL 0.9%生理鹽水經(jīng)心臟快速灌注,置換全血,然后用500 mL含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PB,pH 7.4)灌注固定,持續(xù)60 min以上。灌注結(jié)束后立即打開頭顱,取出腦組織,并置入上述新鮮固定液中后固定6h,然后再將組織移入含30%蔗糖的PB中,置于4℃冰箱至其沉底。固定完成后將大鼠腦部分離,取雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglia TG)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(trigeminal nucleus caudalis,TNC)3個部位,以冰凍切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片,每片厚度為25μm,每10張取2張,將切片分別收集與0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽水(PBS,pH= 7.4)之中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 Fos陽性細(xì)胞觀察方法及統(tǒng)計學(xué)處理

在模型大鼠顱內(nèi)雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核進(jìn)行Fos陽性細(xì)胞計數(shù),同時用配套數(shù)碼相機(jī)采集圖像。對每張標(biāo)本,在10×10倍鏡照片上任意選取三個區(qū)域,大小:100μm×100μm,并用ImageJ軟件對陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計,之后取三個區(qū)域的平均值,作為該大鼠該相應(yīng)區(qū)域該蛋白陽性細(xì)胞數(shù)。計量數(shù)據(jù)利用Image-Pro Plus軟件(6.0版)對10倍物鏡下切片的c-Fos陽性細(xì)胞分別進(jìn)行計數(shù),用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件。

2 結(jié)果

各組在右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)的c-Fos平均免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)分別為(66.60±7.35),(37.00± 8.10),(36.3±7.75),三者之間差異有顯著性(P＜0.05)。多重兩兩比較結(jié)果示鹽水對照組與對乙酰氨基酚組比較差異有顯著性(P＜0.01),鹽水對照組與布洛芬組比較差異有顯著性(P＜0.01);可見圖1A、D及圖2(圖1見彩插6)。

各組在左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)的c-Fos平均免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)分別為(64.50±5.28),(37.50± 5.80),(35.80±5.61),三者之間差異有顯著性(P＜0.01)。多重兩兩比較結(jié)果示鹽水對照組與對乙酰氨基酚組差異有顯著性(P＜0.01),鹽水對照組與布洛芬組差異有顯著性(P＜0.01);可見圖1B、E及圖3。

各組在三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核的c-Fos平均免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)分別為(80.80±7.47), (36.70±7.07),(35.30±6.55),三者之間差異有顯著性(P＜0.01)。多重兩兩比較結(jié)果示鹽水對照組與對乙酰氨基酚組,差異有顯著性(P＜0.05),對照組與布洛芬組差異有顯著性(P＜0.01);可見圖1C、F及圖4。

圖2 各組在右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)Fos陽性細(xì)胞數(shù)比較Fig．2 Comparison of Fos-positive cells in the right trigeminal ganglia by each group

上述三個區(qū)域在Fos陽性細(xì)胞比較中對乙酰氨基酚組與布洛芬組差異均無顯著性(P＞0.05)。對照組中右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)與左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)之間的Fos陽性細(xì)胞數(shù)差異無顯著性(P=0.673),對乙酰氨基酚組中右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)與左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)之間的Fos陽性細(xì)胞數(shù)差異無顯著性(P=0.524),布洛芬組中右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)與左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)之間的Fos陽性細(xì)胞數(shù)差異無顯著性(P=0.707)。

圖3 各組在左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)Fos陽性細(xì)胞數(shù)比較Fig．3 Comparison of Fos positive cells in the left trigeminal ganglia by each group

圖4 各組在三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核Fos陽性細(xì)胞數(shù)比較Fig．4 Comparison of Fos-positive cells in trigeminal nucleus caudalis by each group

3 討論

c-fos基因是一類廣泛存在于原核細(xì)胞和直核細(xì)胞基因組內(nèi)高度保守的基因,屬于即刻早期基因(immediate-early gene,IEG),它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Fos蛋白作為細(xì)胞功能活動狀態(tài)的標(biāo)志,對神經(jīng)遞質(zhì)、激素、神經(jīng)沖動及外界剌激引起的傳入信息,在數(shù)分鐘中就會作出反應(yīng),進(jìn)行表達(dá)。基于此種原因,通過對c-fos的檢測可探索研究機(jī)能與形態(tài)的關(guān)系［5］。既往研究表明,Fos蛋白的表達(dá)量可以較為直觀的作為細(xì)胞水平的代謝性標(biāo)記顯示神經(jīng)元活性:Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)可作為神經(jīng)元活性增強(qiáng)的標(biāo)志,既往有學(xué)者的研究表明傷害性刺激誘導(dǎo)的c-fos陽性標(biāo)記神經(jīng)元的表達(dá)結(jié)果與行為學(xué)和電生理學(xué)的研究結(jié)果相一致。c-Fos蛋白對外界刺激非常敏感,在中樞某些部位的表達(dá)可作為傷害性刺激所引起的疼痛在分子水平上的標(biāo)志物。在疼痛研究中許多學(xué)者將c-Fos蛋白表達(dá)作為研究傷害性信息傳導(dǎo)通路的標(biāo)識物［6,7］。正常情況下,細(xì)胞內(nèi)c-Fos蛋白很少表達(dá),外周傷害性刺激等因素可激活脊髓內(nèi)、三叉神經(jīng)系統(tǒng)、丘腦-皮層通路中c-Fos基因并表達(dá)c-Fos蛋白。一定程度上,c-Fos蛋白免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的數(shù)量與所受刺激的強(qiáng)度成正比,因此c-Fos蛋白可作為傷害性刺激的標(biāo)志物,是疼痛在分子水平的標(biāo)志［8］。由于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(TGVS)在偏頭痛的病理生理中起著舉足輕重的作用。三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的活性增強(qiáng),被認(rèn)為是基礎(chǔ)神經(jīng)過敏促進(jìn)慢性疼痛發(fā)作,包括偏頭痛的發(fā)作。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜后在雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核質(zhì)出現(xiàn)Fos表達(dá),尤其在三叉神經(jīng)節(jié)表達(dá)最明顯［9］。三叉神經(jīng)節(jié)是一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜,功能豐富的區(qū)域,它廣泛參與疼痛與鎮(zhèn)痛、恐懼和焦慮等功能活動的調(diào)控,是重要的感覺、運(yùn)動整合中樞及自主調(diào)節(jié)中樞［10］。模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)及TNC fos表達(dá)均明顯增高,通過藥物干預(yù)后fos表達(dá)均有所下降。也有研究表明,偏頭痛發(fā)作時三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核、丘腦等部位同樣受影響,這些部位cfos同樣會出現(xiàn)高表達(dá)。

本實(shí)驗結(jié)果顯示布洛芬及對乙酰氨基酚兩藥均可導(dǎo)致患者顱內(nèi)雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核c-fos的表達(dá)均較用藥前明顯減少,且差異具備統(tǒng)計學(xué)意義。在左側(cè)、右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)區(qū)域表達(dá)未見明顯差異,提示疼痛傳遞自雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)同時進(jìn)行,向腦干、丘腦區(qū)域傳遞。在對乙酰氨基酚組及布洛芬組進(jìn)行比較時,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但仍存在不同,以布洛芬效果略優(yōu)于對乙酰氨基酚,在一項針對高海拔頭痛一項隨機(jī),對照試驗中驗證對乙酰氨基酚與布洛芬的療效,結(jié)果顯示兩藥對頭痛均有效,未見明顯差異［11,12］;在一項托吡酯、布洛芬或?qū)σ阴０被訉ζ^痛影響的隨機(jī)對照研究中結(jié)果顯示,400 mg布洛芬或1000 mg對乙酰氨基酚280 mg托吡酯的結(jié)合并未顯示出統(tǒng)計上的顯著差異［13,14］。布洛芬為芳基丙酸類,為選擇性COX-2抑制劑,可以實(shí)現(xiàn)非甾體抗炎藥的全部作用,通過抑制誘導(dǎo)型致炎性環(huán)氧酶將花生四烯代謝為介質(zhì)前列腺素或其他遞質(zhì)的合成,減輕前列腺素所致局部組織充血、腫脹、發(fā)熱;通過抑制白細(xì)胞活動及溶酶體釋放,降低局部周圍神經(jīng)對緩激肽等致痛物質(zhì)的痛覺敏感性,減少組織沖動,從而起到鎮(zhèn)痛作用［15］。對乙酰氨基酚為乙酰苯胺類,為非選擇性COX抑制劑,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)前列腺素抑制作用比對外周的前列腺素抑制所用強(qiáng),但其抗炎作用較弱。在組織損傷或炎癥時,局部產(chǎn)生和釋放致痛物質(zhì),同時PGs的合成增加。在本實(shí)驗中,通過對c-Fos的檢測可以看出兩種藥物在緩解偏頭痛的療效方面無明顯差異,提示血管炎性反應(yīng)可能不是引發(fā)電刺激上矢狀竇大鼠模型偏頭痛發(fā)作的主要因素,非甾體抗炎藥可能通過對外周及中樞神經(jīng)元的直接作用產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng),結(jié)合此觀點(diǎn)提示血管炎性反應(yīng)可能不是引發(fā)電刺激上矢狀竇模型大鼠偏頭痛發(fā)作的主要因素,具體機(jī)理機(jī)制尚須進(jìn)一步研究。

(本文圖1見彩插6。)

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Effects of NSAIDs on Fos expression in conscious rat model of vasculogenic headache

WANG Xiao-hui1,ZHU Hao-jing1,WANG Heng1,SUN Yu1,WU Shi-wen1,YU Sheng-yuan2,
(1.General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China;2.PLA Postgraduate Medical School,Beijing 100853)

Ob jectiveTo define the functionalmechanisms of two NSAIDs,paracetamol and ibuprofen,in specific brain regions in headache control by observing the distribution of Fos-immunoreactive neurons in trigeminal ganglia and trigeminal nucleus caudalis in conscious ratmodels of vasculogenic headache.M ethodsThirtymale Sprague-Dawley rats were random ly divided into three groups:control group(saline group),acetaminophen group and ibuprofen group.Each ratwas given electrical stimulation(frequency 20 Hz,current3-5 mA,pulse width 0.25 ms)at50 minutes after injection.The ratswere killed and perfusion fixed after electrical stimulation.Trigeminal ganglia and trigeminal nucleus caudalis of the brainswere taken out for paraffin sections and immunohistochemical staining,and Fos-immunoreactive neuronswere counted under the Image J system.Resu ltsAfter electrical stimulation,there were significant differences of Fos protein expression in bilateral trigeminal ganglia and spinal trigeminal nucleus caudalis between the saline group and groups of nonsteroidal anti-inflammatory drugs,but no significant difference of Fos protein expression in bilateral trigeminal ganglia and spinal trigeminal nucleus caudalis between the acetaminophen group and ibuprofen group.ConclusionsThe changes of Fos expression in bilateral trigeminal ganglia and spinal trigeminal nucleus caudalis after treatment with NSAIDs suggest that such structures participate in the pain transmission and expression and the pharmacology course of analgesic drugs.

Migraine;Non-steroidal anti-inflammatory analgesics;Acetaminophen,Ibuprofen,Fos,expression

Q95-33

A

1005-4847(2014)03-0040-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.008

2013-11-05

國家自然科學(xué)基金項目(30570264,30970417)。

王曉輝(1981-),男,碩士,研究方向:原發(fā)性頭痛。E-mail:wangxh_001@sina.com

于生元,男,博士生導(dǎo)師。E-mail: yusy1963@126.com