兩品系小鼠食物過敏模型的比較

趙新鳳，曾本華，譚毅，魏泓，程茜

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地,重慶 400014; 2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室,重慶 400038;3.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中心,重慶 400016)

研究報(bào)告

兩品系小鼠食物過敏模型的比較

趙新鳳1，曾本華2，譚毅3，魏泓2，程茜1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地,重慶 400014; 2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室,重慶 400038;3.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中心,重慶 400016)

目的比較兩種不同品系小鼠食物過敏模型的敏感性和腸道菌群變化的差異,旨在為食物過敏模型的建立提供依據(jù)。方法分別對(duì)30只4～5周齡BALB/c和KM雌鼠用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏建立食物過敏模型,ELISA法檢測(cè)小鼠血清OVA特異性IgE水平;HE染色觀察空腸組織形態(tài);采用DGGE技術(shù)檢測(cè)糞便菌群的變化。結(jié)果(1)30只致敏的BALB/c小鼠中有27只血清OVA特異性IgE水平明顯升高(P＜0.001),而30只致敏的KM小鼠中有21只,且BALB/c小鼠空腸絨毛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮脫落及壞死比KM小鼠明顯;(2)食物過敏造模后,BALB/c小鼠腸道菌群的改變明顯(P＜0.001),而KM小鼠中僅有均勻度改變顯著(P＜0.05);(3) BALB/c小鼠和KM小鼠對(duì)照組腸道菌群的豐富度、Shannon指數(shù)及均勻度都有差異。結(jié)論BALB/c小鼠對(duì)OVA的敏感性高于KM小鼠,不同品系小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)不同,OVA處理后,BALB/c小鼠菌群的改變比KM小鼠更明顯。

小鼠;食物過敏;模型;卵蛋白;敏感性;腸道菌群

食物過敏已成為威脅人類健康的主要問題,尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家,其發(fā)病率在成人為3%、兒童為6%［1,2］。然而,食物過敏的發(fā)病機(jī)制仍不明確,需要合適的食物過敏模型以便于更深入的研究。目前已有的BALB/c小鼠、C57小鼠模型敏感性太高,不符合人群的發(fā)病規(guī)律,且近交系個(gè)體之間相同的遺傳組成與人類個(gè)體之間的遺傳異質(zhì)性差異很大。因此本實(shí)驗(yàn)建立兩種不同品系小鼠的食物過敏模型,以評(píng)價(jià)封閉群KM小鼠和近交系BALB/c小鼠在食物過敏模型中的敏感性和了解腸道菌群變化的差異性,旨在建立與人發(fā)病規(guī)律更接近的過敏模型,為食物過敏與腸道菌群關(guān)系的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c和KM小鼠各40只,4～5周齡,體重15.5～17 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(渝)2007-0002】,實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(渝)2012-0002】。喂飲條件為:溫度20～25℃,12 h/12 h晝夜規(guī)律照明,自由飲水與進(jìn)食。以特殊飼料(不含雞蛋)飼養(yǎng),飼料基本成分均按規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量配制,具體如下:

動(dòng)物飼料配方(每50 kg含量):玉米12.5 kg、麥麩5 kg、豆粨7.5 kg、次粉10 kg、魚粉7 kg、骨粉1 kg、酵母粉2.5 kg、植物油0.75 kg、動(dòng)物油0.25 kg、鹽0.5 kg、魚肝油0.5 kg、維生素E 0.25 kg、復(fù)合維生素80 g、水4 L。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

每品系40只雌鼠,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組30只、對(duì)照組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)腸道激發(fā)致敏,對(duì)照組給予等量生理鹽水,于實(shí)驗(yàn)第28天末次激發(fā)2 h內(nèi)處死小鼠,留取標(biāo)本。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立

［3］方法?；A(chǔ)致敏:實(shí)驗(yàn)的第1天經(jīng)腹腔注射給予含10μg OVA(V級(jí),Sigma公司)和1 mg氫氧化鋁(Sigma公司)的生理鹽水,每只0.5 mL。強(qiáng)化致敏:于實(shí)驗(yàn)第15天經(jīng)腹腔注射含10μg OVA (V級(jí),Sigma公司)的生理鹽水,每只0.5 mL。腸道激發(fā):于實(shí)驗(yàn)第20天起至第28天,用500 mg/L OVA (II級(jí),Sigma公司)溶液隔日進(jìn)行灌胃,每只0.2 mL。1.2.3 血清OVA特異性IgE水平的檢測(cè)

采用ELISA法。血清OVA特異性IgE水平檢測(cè):末次激發(fā)后2 h內(nèi)經(jīng)眼球取血,分離血清,以10 μg/mL OVA包板,每孔100μL,1%牛血清白蛋白封閉,每孔200μL;加入血清樣品(1∶1)稀釋,每孔100 μL;加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgE(1∶1000稀釋) (Southern Biotechnology Associates),每孔100μL; TMB(凱基生物)顯色后終止反應(yīng),使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIO-RAD,USA)在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)A值。

1.2.4 腸道組織學(xué)觀察

處死小鼠,取0.5 cm空腸固定,蘇木素-伊紅染色,鏡下觀察空腸絨毛組織形態(tài)。

1.2.5 糞便菌群檢測(cè)

于末次灌胃前收集小鼠糞便,進(jìn)行denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)分析。

(1)糞便菌群總DNA的提取:樣品置于2 mL螺口管(Biospec)中,加入700μL裂解液、250μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和0.3 g鋯珠,混勻,用Mini-Beadbeater-16(Biospec,USA)研磨 2 min, 12 000 r/min離心 5 min,取上清,加入 250μL 10 mol/L乙酸銨,然后使用2次酚/氯仿/異戊醇和氯仿抽提,異丙醇沉淀,70%的乙醇洗滌,風(fēng)干后,加入50μL去離子水和2μL DNA free-RNAase(生工生物),37℃孵育15 min。取2μL的DNA溶液于NanoDrop ND-1000核酸定量?jī)x中測(cè)定其DNA含量和純度。

(2)PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增16S rRNA基因V6-V8區(qū)引 物 為 U968F(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGC GAAGAACCTTA-3’),L1401R(5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’)。擴(kuò)增體系:25μL,包括12.5μL 2 PCR MasterMix,0.5μL 10 mol/L的引物,1μL 100 ng/μL的DNA模板,10.5μL的ddH2O。反應(yīng)條件:94℃5 min,94℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃7 min。

(3)DGGE分析:PCR產(chǎn)物用DGGE進(jìn)行分析,采用Bio-Rad公司DcodeDGGE系統(tǒng),做法參照Rowan等方法。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝膠,采用45%～58%變形梯度。首先在220 V電壓下預(yù)電泳10 min,隨后85 V電泳16 h。電泳結(jié)束后,進(jìn)行硝酸銀染色。DGGE凝膠采用Quantity One進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用One-way ANOVA方差分析,Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血清OVA特異性IgE水平

ELISA法測(cè)定血清OVA特異性IgE水平,以X +2SD為標(biāo)準(zhǔn),大于對(duì)照組X+2SD為過敏組,小于對(duì)照組X+2SD為無(wú)反應(yīng)組。結(jié)果顯示,KM對(duì)照組OVA-sIgE(0.45±0.12)和BALB/c對(duì)照組(0.69± 0.17)差異無(wú)顯著性(P＞0.05),實(shí)驗(yàn)組血清中的OVA-sIgE與對(duì)照組相比,30只BALB/c中有27只(2.10±0.64)大于對(duì)照組(0.69±0.17)兩倍的SD (P＜0.001),而30只KM中有21只(2.00±0.67)大于對(duì)照組(0.45±0.12)兩倍的SD(P＜0.001)。

2.2 腸道組織學(xué)變化

空腸組織切片HE染色(見圖1,彩插4)可見BALB/c小鼠和KM小鼠實(shí)驗(yàn)組的空腸絨毛上皮細(xì)胞局灶壞死、脫落,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)組更嚴(yán)重。

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 DGGE圖譜

由圖2可得,BALB/c和KM小鼠各組之間既有共有條帶又有差異條帶,即使是同一位置的條帶,明暗程度也各有不同。如條帶2和5在各組中是共有的,而條帶1只在BALB/c過敏組明顯可見,條帶7在BALB/c對(duì)照組中可見,可見食物過敏造模使腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。條帶6存在于KM小鼠中,而在BALB/c小鼠中不明顯,說明不同品系的小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)也不同。

2.3.2 16SrRNA基因V6-V8區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜的條帶分析及相似性UPGMA聚類分析

(1)UPGMA聚類分析:對(duì)V3-DGGE指紋圖譜進(jìn)行多樣性指數(shù)分析(見表1),結(jié)果表明:BALB/c小鼠的過敏組和對(duì)照組比較,豐富度、Shannon指數(shù)和均勻度均有明顯差異(P＜0.001);而KM小鼠的過敏組和對(duì)照組相比,只有均勻度差異有顯著性(P＜0.05)。BALB/c小鼠的對(duì)照組和KM小鼠的對(duì)照組比較,豐富度(P＜0.001)、Shannon指數(shù)(P＜0.001)和均勻度(P＜0.05)差異有顯著性。

注:泳道上方數(shù)字為泳道編號(hào)。1～6號(hào)泳道為BALB/c過敏組,7～12號(hào)泳道為BALB/c對(duì)照組,13～18號(hào)泳道為KM對(duì)照組組, 19～24號(hào)泳道為KM過敏組。圖2 BALB/c和KM各組小鼠腸道菌群V6-V8區(qū)DGGE圖譜Note:1-6:BALB/c food allergy groups,7-12:BALB/c control groups,13-18:KM control groups,19～24:KM food allergy groupsFig．2 V6-V8 DGGE profiles of the intestinal flora between the BALB/c and KM mice

(2)多樣性分析:DGGE圖譜的聚類分析(圖3)顯示各組之間的總相似度為13%。BALB/c過敏組1-6聚成一簇,其余幾組也大部分分別獨(dú)成一簇,說明各組之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。結(jié)果提 示,小鼠的聚類與品系和食物過敏造模明顯相關(guān)。

表1 BALB/c和KM小鼠對(duì)照組與過敏組V6-DGGE指紋圖譜的多樣性指數(shù)分析Tab．1 Diversity indexes of the V6-DGGE profile between control and FA groups of BALB/c and KM mice

圖3 BALB/c和KM小鼠對(duì)照組和過敏組糞便菌群PCR-DGGE圖譜聚類分析Fig．3 Dendrogram of PCR-DGGE profiles of the microbiota in the control and FA groups of BALB/c and KM mice

2.3.3 DGGE指紋圖譜的PCA分析

對(duì)各組DGGE指紋圖譜進(jìn)行PCA分析,根據(jù)各樣品在第一和第二主成分的分值繪制PCA圖(圖4)。X坐標(biāo)表示第一主成分(48.551%),Y坐標(biāo)表示第二主成分(27.306%)。圖中可以看出,各組絕大部分在PCA分析圖中分離,其中BALB/c和KM過敏組有所聚攏。

3 討論

圖4 BALB/c和KM小鼠對(duì)照組和過敏組糞便菌群PCR-DGGE圖譜PCA分析Fig．4 PCA analysis of the PCR-DGGE profiles in the control and FA groups of BALB/c and KM mice

國(guó)際上目前仍未建立標(biāo)準(zhǔn)的食物過敏模型,常用的動(dòng)物種類和品種有很多,但國(guó)內(nèi)最常用的是BALB/c小鼠。然而BALB/c小鼠作為食物過敏動(dòng)物模型的可行性一直存在爭(zhēng)議［4,5］。Deman等［5］認(rèn)為BALB/c是合適的動(dòng)物模型,呂相征［6］等研究發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠對(duì)無(wú)致敏史的食物也產(chǎn)生過敏反應(yīng),與人體過敏反應(yīng)的情況差異較大,指出BALB/c小鼠不適合作為食物過敏動(dòng)物模型。雞蛋蛋白是最常見食物過敏原,而OVA是雞蛋蛋白的主要成分,因此本實(shí)驗(yàn)食物過敏模型采用 OVA激發(fā)致敏。OVA致敏小鼠的食物過敏以IgE介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)為主,致敏小鼠出現(xiàn)特異性的IgE水平升高,空腸絨毛破損、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),證實(shí)IgE介導(dǎo)的食物過敏動(dòng)物模型建立成功。本研究中致敏的30只BALB/c小鼠血清OVA特異性IgE的水平有27只明顯高于對(duì)照組,而KM小鼠中僅有21只和對(duì)照組有顯著差異;并且BALB/c小鼠小腸的組織形態(tài)學(xué)改變要明顯嚴(yán)重于KM小鼠,說明了BALB/c小鼠對(duì)OVA的敏感性高于KM小鼠。這可能與BALB/c小鼠是近交系小鼠,其基因背景一致有關(guān)。正是因?yàn)锽ALB/c小鼠的敏感性高,所以常被用于食物過敏的造模。而KM小鼠基因背景可能與人類更相似,各個(gè)小鼠間遺傳背景差異大,敏感性不可能完全一致,可以更直實(shí)地反映OVA致敏時(shí)所造成的機(jī)體過敏反應(yīng)狀態(tài)。故我們認(rèn)為,在建立食物過敏模型時(shí),應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用不同的小鼠品系或品種。人類在接觸相同的食物時(shí)一小部分人會(huì)出現(xiàn)過敏現(xiàn)象,而大部分人正常,這可能是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果。通過OVA致敏后過敏小鼠和無(wú)反應(yīng)小鼠之間的差異來研究食物過敏與腸道菌群作用,相對(duì)敏感性低的小鼠模型比較適合。

通過比較BALB/c和KM小鼠對(duì)照組的腸道菌群結(jié)構(gòu),可以看出不同品系的小鼠其腸道菌群結(jié)構(gòu)不同。Campbell等［7］研究了不同品系小鼠的腸道菌群發(fā)現(xiàn),小鼠的品系與腸道菌群顯著相關(guān),與我們的研究結(jié)果相似。張曉婧等［8］的研究也指出不同遺傳背景的小鼠對(duì)腸道菌群具有選擇性的定植效果。BALB/c小鼠過敏組和對(duì)照組腸道菌群的豐富度、Shannon指數(shù)和均勻度均有顯著差異,而KM小鼠過敏組和對(duì)照組腸道菌群也有不同,但僅有均勻度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明OVA致敏后兩種品系小鼠的腸道菌群有所改變,但改變的程度不同, BALB/c小鼠菌群改變的幅度更大,PCA分析發(fā)現(xiàn)雖然KM和BALB/c差異很大,但過敏發(fā)生時(shí),菌群聚攏,提示菌群的改變相似。食物過敏的發(fā)病機(jī)制還不明確,許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都支持食物過敏與腸道菌群相關(guān)［9,10］,人群研究也顯示食物過敏兒童和正常兒童相比,其腸道菌群不同［11,12］,腸道菌群在食物過敏中的重要性正在被揭示。KM與BALB/c小鼠在食物過敏狀態(tài)下所表現(xiàn)的發(fā)病差異,以及不同品系間小鼠食物過敏后腸道菌群的不同,將可能對(duì)研究食物過敏的機(jī)制提供新的思路和動(dòng)物模型。

(本文圖1見彩插4。)

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Com parison of the BALB/c and Kunm ing mousemodels of food allergy

ZHAO Xin-feng1,ZENG Ben-hua2,TAN Yi3,WEIHong2,CHENG Qian1
(1.Key Laboratory of Child Development and Disorders of Ministry of Education,Chongqing Key Laboratory of Pediatrics,Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders,Children’s Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400014,China; 2.Department of Laboratory Animal Science,College of Basic Medical Sciences,Third Military Medical University, Chongqing 400038;3.Laboratory Animal Center,Chongqing Medical University,Chongqing 400016)

ObjectiveIn order to provide the basis for establishment of food allergy models,we compared the differences of sensitivity and alterations of intestinal flora of food allergy models in two strains ofmice.M ethodsForty 4-5-week old female BALB/c and Kunmimgmice were divided into control group(n=10)and food allergy goup(n= 30),respectively.Ovalbumin(OVA)was injected to themice to establish food allergymodels.Serum OVA-specific IgE of themice was assayed by ELISA.The jejunum tissue was examined by pathology with HE staining.The changes of fecal flora were detected by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).Results(1)Among the sensitized 60 mice, OVA-sIgE levels were significantly increased in 27/30 BALB/c mice and 21/30 KM mice compared with those of control groups(P＜0.001).Moreover,thereweremore evident inflammatory cell infiltration,epithelial cell shedding and cytolysis in the jejunal villiof BALB/cmice than those of KM mice.(2)After food allergymodeling,therewere significant changes of intestinal flora in the BALB/c mice(P＜0.001),while only significant change of evenness was found in the KM mice(P＜0.05).(3)There were changes of abundance,Shannon index and evenness of intestinal flora in themodel groups of BALB/c and KM mice.ConclusionsBALB/cmice aremore sensitive to OVA allergy than KM mice.The composition of intestinal flora is different among different strains ofmice.The changes of intestinal flora after OVA challenge in BALB/c mice aremore obvious than those in KM mice.

Mice;Food allergy;Models;Ovalbumin;Sensitivity;Intestinal flora

Q95-33,R378

A

1005-4847(2014)03-0035-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.007

2013-11-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370906);“973”計(jì)劃(2013CB531406)。

趙新鳳(1987-),女,重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院兒童保健科碩士研究生,從事食物過敏與腸道菌群的研究。

程茜。E-mail: chqq5@126.com