脂多糖誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺病模型大鼠肺支氣管上皮MRP1功能分析

汪珊珊，汪電雷，，陶秀華，汪辰吟，陳金佩，楊麗麗，曹銀

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230038;2.安徽中人科技有限責(zé)任公司藥理組,合肥 230088; 3.安徽合肥市精神病醫(yī)院藥劑科,合肥 230022)

研究報告

脂多糖誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺病模型大鼠肺支氣管上皮MRP1功能分析

汪珊珊1，汪電雷1，，陶秀華2，汪辰吟1，陳金佩1，楊麗麗1，曹銀3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230038;2.安徽中人科技有限責(zé)任公司藥理組,合肥 230088; 3.安徽合肥市精神病醫(yī)院藥劑科,合肥 230022)

目的分析脂多糖(LPS)造模方法對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的肺支氣管上皮細胞多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)功能的影響。方法利用LPS造模方法制備COPD模型大鼠,設(shè)置正常對照組、造模14 d組和造模28 d組,分別測定其呼吸功能;以酚紅外排水平評價大鼠肺支氣管上皮MRP1的功能;同時采用免疫組化法分析各組大鼠肺支氣管上皮MRP1的表達。結(jié)果與正常對照組比較,LPS處理組造模進程中隨時間的延長大鼠的各項肺功能指標明顯下降;靜脈給予酚紅后其BALF中酚紅濃度與血漿酚紅濃度的比值降低;其肺支氣管上皮MRP1蛋白表達顯著性降低。結(jié)論LPS造模方法制備COPD模型大鼠,隨著造模的進程,其肺支氣管上皮細胞MRP1蛋白的功能隨之下調(diào)。

脂多糖;慢性阻塞性肺疾病;多藥耐藥相關(guān)蛋白1;功能;表達;大鼠

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)具有高致死和致殘等特點,是呼吸系統(tǒng)常見疾病之一,其發(fā)病率、死亡率呈逐年增加態(tài)勢。由于很多實驗研究不適合在人體上實施,因此,動物模型在研究COPD發(fā)病機制方面起著重要的作用。目前COPD動物模型造模的方法有吸入劑模型(吸煙模型、SO2模型、NO2模型、氧化劑和顆粒刺激等)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模型、組織降解模型、基因調(diào)控模型、復(fù)合模型［1］等。其中煙熏法和人類COPD的疾病特征最為接近,吸煙模型的動物可以建立起諸多病理特征,如慢性炎癥、肺氣腫、肺動脈高壓及氣道重塑等［2］。多藥耐藥相關(guān)蛋白 1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)是在肺部氧化應(yīng)激及化學(xué)異物或毒物的外排中起著關(guān)鍵性保護作用的外排蛋白［3］。前期研究表明,藥物可以通過上調(diào)MRP1的功能來發(fā)揮治療COPD的作用［4-5］,因此建立合適的動物模型來滿足藥物的評價要求至關(guān)重要。雖然前期研究表明,煙熏復(fù)合霧化吸入木瓜蛋白酶法能成功復(fù)制出COPD模型,且MRP1表達呈進行性下降［6］,但其造模時間長,影響因素較多等不足,這類模型仍有待進一步開發(fā)。LPS模型可引起肺功能下降、肺氣腫、小氣道重塑,產(chǎn)生肺部炎癥等［7］。且LPS模型手術(shù)簡單,復(fù)制時間短,影響因素較少,理論上認為其可代替煙熏法。但據(jù)報道［8］,LPS能夠使RAW 264.7巨噬細胞的MRP1轉(zhuǎn)運體功能和表達增加,LPS誘導(dǎo)的COPD模型是否能引起肺支氣管上皮細胞MRP1轉(zhuǎn)運體功能的改變,以及這種模型能否用于基于改變MRP1轉(zhuǎn)運體的功能發(fā)揮治療COPD的藥物研究仍需進一步探索。因此,本文在 LPS誘導(dǎo)制備COPD模型基礎(chǔ)上,評價其肺支氣管上皮細胞MRP1轉(zhuǎn)運體的功能,同時通過免疫組化法對其肺支氣管上皮細胞MRP1的表達進行研究。為研究COPD狀態(tài)下MRP1功能或者藥物基于影響MRP1功能而具有治療COPD作用的研究提供進一步的參考。

1 材料與儀器

1.1 動物

普通級Wistar雄性大鼠30只,鼠齡8周,體重(200±20)g。由安徽省全椒安立實驗動物有限公司提供【SCXK(蘇)2002-0002】。動物實驗在安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行【SYXK(皖)2005-0002】。

1.2 試劑

LPS(Sigma公司,批號:20120429223);酚紅(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,批號:20080910); NaHCO3(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號: F20100113);0.9%生理鹽水(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司,批號:100803K6);NaOH(上?；瘜W(xué)試劑有限公司,批號:030124)。一抗兔抗鼠MRP1抗體(Santa Cruz公司);二抗生物素化山羊抗兔工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

TGL-16GB臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);徠卡RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(上海徠卡儀器有限公司);亞鵬BM-IX生物組織包埋機(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);AniRes2005型肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司);721型分光光度計(上海第三分析儀器廠);亞鵬CS-Ⅵ型攤片烤片機(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);亞鵬TS-12A生物組織自動脫水機(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)。

2 方法

2.1 酚紅標準溶液的配制

精密稱取酚紅10.00 mg,用5%NaHCO3溶液溶解后,用 pH 8.95的0.9%生理鹽水定容至10 mL,配制成1 mg/mL的酚紅儲備液。

2.2 動物實驗

2.2.1 LPS模型實驗分組及COPD模型的建立

大鼠正常飼養(yǎng)7 d后進行實驗,隨機分為正常對照組、造模14 d組、造模28 d組,每組各10只。實驗前均禁食不禁水12 h。造模14 d組大鼠于造模的第1天,造模28 d組大鼠于造模的第1天和第14天分別用烏拉坦(2 g/kg)腹腔注射麻醉后暴露氣管,用1 mL注射器向氣管內(nèi)注入200μg LPS,手術(shù)完成后縫合,正常飼養(yǎng)［9-10］。

2.2.2 呼吸功能測定

將正常對照組、造模14 d組、造模28 d組大鼠用烏拉坦(2 g/kg)腹腔注射麻醉,然后切開氣管,插管,結(jié)扎,放置于小動物呼吸機內(nèi),檢測第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3%)及其占預(yù)計值的百分比(FEV%),最大呼氣中段流量(MMF),呼氣流量峰值(PEF)及肺順應(yīng)性(Cldyn)。

2.2.3 肺上皮細胞MRP1轉(zhuǎn)運體功能的評價

以MRP1底物酚紅作為工具藥,測定大鼠靜脈注射酚紅后肺泡灌洗液(BALF)中酚紅濃度與血漿中酚紅濃度的比值,作為評價COPD大鼠肺支氣管上皮細胞MRP1的功能指標［11］。各組大鼠分別由尾靜脈注射1% 酚紅生理鹽水溶液(25 mg/kg)。30 min后腹主動脈采血置于經(jīng)肝素鈉處理的EP管中,離心10 min(3000 r/min),取血漿0.2 mL加入NS-NaOH(1 mol/L)溶液(29∶1)稀釋液3 mL,混勻,以545 nm為測定波長,采用分光光度法測定其吸光度［12］。同時分離氣管插入磨平的9號注射針頭,用5%NaHCO3溶液(3 mL)沖洗3次,沖洗液合并(回收率70%～80%),離心,得到紅色透明上清液,即BALF,以545 nm為測定波長,采用分光光度計測定其吸光度［13-15］。

2.2.4 免疫組化檢測分析

采用免疫組化S-P的方法。取LPS模型組大鼠的右肺中葉石蠟切片,脫蠟、水化;細胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶;抗原修復(fù)暴露抗原決定族;封閉非特異性蛋白;滴加一抗即兔抗鼠 MRP1抗體(1∶150),4℃孵育過夜;滴加二抗即生物素化山羊抗兔工作液;DAB顯色,蘇木素復(fù)染胞核,逐級乙醇脫水,透明;中性樹膠封片,顯微鏡觀察。在200倍視野下,選擇肺組織分布均勻、染色均勻的視野攝片,采用IPP 6.0軟件進行分析［16］。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同組別間大鼠肺功能指標測定結(jié)果比較

將正常對照組、造模14 d組、造模28 d組大鼠進行肺功能指標測定。其結(jié)果見表1。

結(jié)果表明:與正常對照組比較,造模14 d組大鼠的各項肺功能有下降的趨勢;而造模28 d組大鼠各項肺功能指標差異有顯著性(P＜0.05)。

3.2 不同組別間BALF中酚紅濃度與血漿中酚紅濃度的比值比較

正常對照組、造模14 d組、造模28 d組大鼠BALF中酚紅濃度及其血漿中酚紅濃度進行測定,其結(jié)果見表2。

表1 不同組別間大鼠肺功能指標測定結(jié)果比較(±s,n=10)Tab．1 Comparison of the pulmonary function in the rats of different groups

表1 不同組別間大鼠肺功能指標測定結(jié)果比較(±s,n=10)Tab．1 Comparison of the pulmonary function in the rats of different groups

注:與正常對照組比較,Note:＊P＜0.05。Note:Compaed with the normal control group,*P＜0.05.

組別Groups FEV0.3%/FVC MMF PEF Cldyn正常對照組Normal control 0.914±0.061 3.893±0.594 4.276±0.970 0.628±0.051造模14 d組Modeling,14 d 0.868±0.090 3.308±0.758 3.631±0.754 0.545±0.182造模28 d組Modeling,28 d 0.707±0.218＊2.249±0.414＊2.874±0.598＊0.428±0.078＊

表2 不同組別間BALF中酚紅濃度及其與血漿中酚紅濃度的比值比較(±s,n=10)Tab．2 Concentrations and ratios of phenol red in the BALF and plasma of rats in different groups

表2 不同組別間BALF中酚紅濃度及其與血漿中酚紅濃度的比值比較(±s,n=10)Tab．2 Concentrations and ratios of phenol red in the BALF and plasma of rats in different groups

注:與正常對照組比較。Note:Compared with the normal control group,＊P＜0.05.

BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度BALF phenol red/ Plasma phenol red正常對照組Normal control 2.66±1.09 86.32±35.95 0.0320±0.0119造模14 d組Modeling,14 d 2.41±0.49 85.85±11.91 0.0280±0.0030造模28 d組Modeling,28 d 0.77±0.39＊83.30±7.39 0.0094±0.0054組別Groups BALF中酚紅濃度BALF phenol red concentration(μg/mL)血漿中酚紅濃度Plasma phenol red concentration(μg/mL)＊

結(jié)果表明:與正常對照組比較,大鼠靜脈給予酚紅后,造模進程中BALF中酚紅的濃度,血漿中酚紅的濃度以及BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度均有下降的趨勢,同時造模28 d后,BALF中酚紅的濃度以及BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度值顯著降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3 LPS模型各組大鼠肺支氣管上皮MRP1表達的比較

各組大鼠肺組織免疫組化中MRP1表達用平均光密度值表示,結(jié)果分別為正常對照組(0.388± 0.102);造模14 d組(0.230±0.923);造模28 d組(0.187±0.040)。正常對照組中(圖1A),MRP1蛋白表達較強(棕黃色顆粒為陽性產(chǎn)物);而在LPS模型組(圖1B,圖1C)中表達降低,與正常組比較,其平均光密度均降低,且造模28 d組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖1見彩插5)。

4 討論

前期在調(diào)研相關(guān)文獻后,我們采用煙熏復(fù)合霧化吸入木瓜蛋白酶法復(fù)制出COPD模型大鼠,能成功用于基于影響MRP1功能藥物評價研究［5］,但實驗過程繁瑣,模型不穩(wěn)定,需要控制的因素較多。為了進一步探索復(fù)制的模型更簡便、可靠、均一的特點,同時更利于驗證COPD狀態(tài)下肺支氣管上皮細胞MRP1的改變,及基于影響MRP1功能而具有治療COPD作用的藥物研究,本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠的COPD模型,觀察其肺支氣管上皮MRP1表達和功能的改變。因LPS誘導(dǎo)的COPD模型是成熟的模型制備方法,所以在研究中我們僅以肺功能測定的改變?yōu)槠涮卣髡f明是否已成功復(fù)制出COPD模型大鼠,其COPD的病理變化參考馬楠［9］首次利用LPS注入氣管成功復(fù)制出大鼠慢性支氣管炎模型,研究表明其符合COPD病理變化。試驗中為表現(xiàn)COPD疾病形成過程中,其肺支氣管上皮MRP1表達和功能的變化,在造模過程中,選擇14 d及造模成功后分析,即設(shè)造模14 d組與造模28 d組。理想的COPD大鼠模型應(yīng)具有與人類疾病相一致的以氣流受限為特征的肺功能改變,故實驗中測定了FEV0.3%/FVC,MMF,PEF,Cldyn這幾個反映大鼠肺功能的指標,結(jié)果顯示與正常對照組相比,造模14 d組大鼠肺功能下降,造模28 d組大鼠的肺功能顯著性降低(表1,P＜0.05),這表明LPS誘導(dǎo)的大鼠COPD模型復(fù)制成功,同時LPS處理組造模進程中,隨時間的延長大鼠的各項肺功能指標明顯下降。與煙熏復(fù)合霧化吸入木瓜蛋白酶法相比,LPS法簡便、省時、省力、影響因素小且成功率高。

MRP1是一種依賴于ATP介導(dǎo)底物跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,是ABC轉(zhuǎn)運家族中的重要一員,在正常人肺支氣管上皮細胞高度表達［17-18］,能對吸入性化學(xué)異物或毒物以及體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)起外排作用,所以與肺部的屏障作用密切相關(guān)。通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn),COPD患者的支氣管上皮細胞中MRP1的表達會減少,重度COPD患者比中度COPD患者支氣管上皮細胞中MRP1表達減少［19］。據(jù)報道,在體外細胞中可利用特異性底物的外排水平來評價MRP1的功能,而在體評價MRP1功能的方法較少。故在前期研究中,課題組選用MRP1的特異性底物——酚紅作為工具藥,利用其外排水平來評價肺上皮細胞MRP1的功能［11］。本實驗主要以 BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度的比值來評價MRP1的功能,這一指標即直接反映了COPD模型大鼠肺部MRP1的外排水平也排除了因血漿中酚紅濃度不同帶來的誤差。實驗數(shù)據(jù)顯示,造模14 d大鼠BALF中酚紅的濃度以及BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度均下降,而造模28 d大鼠BALF中酚紅的濃度以及BALF中酚紅濃度/血漿中酚紅濃度值顯著降低,且均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2,P＜0.05)。造模14 d和造模28 d組大鼠血漿中酚紅濃度與正常對照組比較有所降低但差異無顯著性,研究表明大鼠肺支氣管上皮細胞MRP1的功能隨著COPD造模進程逐漸下調(diào)。

同時,為進一步分析COPD模型大鼠肺支氣管上皮MRP1的功能改變是否與其表達有關(guān),我們采用免疫組化對其蛋白水平分析,圖1可明顯發(fā)現(xiàn),正常對照組MRP1表達呈強陽性,與正常組比較,造模14 d組平均光密度值降低,造模28 d組平均光密度值降低顯著降低。這從另一方面證明肺支氣管上皮MRP1蛋白的功能在COPD造模過程中逐漸下調(diào)。

綜上所述,本實驗利用LPS復(fù)制的COPD模型大鼠,隨著造模的進程,其肺支氣管上皮細胞MRP1蛋白的功能隨之下調(diào)。所復(fù)制的COPD大鼠模型在肺支氣管上皮細胞MRP1轉(zhuǎn)運體功能的改變上,與本實驗室前期研究的基于煙熏復(fù)合霧化吸入木瓜蛋白酶法復(fù)制出COPD模型,其MRP1表達和功能上無明顯區(qū)別。因此,該模型能用于基于MRP1轉(zhuǎn)運體的COPD的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律奠定基礎(chǔ),以及基于改變MRP1轉(zhuǎn)運體的功能發(fā)揮治療COPD的藥物評價研究,同時為在臨床上藥物通過逆轉(zhuǎn)MRP1功能的COPD的治療提供了新思路與方法。

(本文圖1見彩插5。)

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MRP1 expression and bronchial epithelial function in lipopolysaccharideinduced ratmodel of chronic obstructive pulmonary disease

WANG Shan-shan1,WANG Dian-lei1,TAO Xiu-hua2,WANG Chen-yin1,CHEN Jin-pei1,YANG Li-li1,CAO Yin3
(1.College of Pharmacy,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei230038,China;2.Pharmacology Dept, Anhui Sino-Implant Co.,Ltd,Hefei230038; 3.Pharmacy Dept,the Fourth People’s Hospital of Hefei,Hefei230022)

ObjectiveTo study the impact of establishment of lipopolysaccharide(LPS)-induced ratmodel of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)on the function ofmultidrug resistance-associated protein 1(MRP1)in the rat bronchial epithelium.M ethodsUsing intratracheal instillation of LPS to establish COPD ratmodel.8-week old healthy maleWistar rats were divided into 3 groups(10 rats in each group):(1)Normal control;(2)Modeling for 14 days after LPS instillation;(3)Modeling for28 days after LPS instillation.Pulmonary function and the concentration of phenol red in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and plasma were measured.The ratio of phenol red concentration in BALF/plasma was used as an index of the MRP1 function in the ratbronchial epithelium and the expression ofMRP1 in the bronchialepithelium was also observed by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group,the pulmonary functions of the rats in themodel groupswere significantly reduced alongwith themodeling progress.After intravenous administration of phenol red,the ratio of phenol red concentration in BALF/plasmawas gradually reduced,and the expression ofMRP1 in the bronchial epithelium was significantly decreased.ConclusionsCOPD ratmodel can be established by intratrachealLPS instillation,and the function ofMRP1 in bronchial epithelium was gradually reduced alongwith themodeling progress.

Lipopolysaccharide;Chronic obstructive pulmonary disease;Multidrug resistance-associated protein 1;Function;Expression;Rat

Q95-33

A

1005-4847(2014)03-0030-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.006

2013-10-29

國家重大新藥創(chuàng)制資助項目(No 2009ZX09103-399);國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81001592);教育部科學(xué)技術(shù)重點項目(No 210101);安徽高校省級自然科學(xué)研究重點項目資助(No KJ2010A210,KJ2012A186)。

汪珊珊(1989-),女,碩士研究生,藥物代謝動力學(xué)研究,Tel:13956913874,E-mail:277024827@qq.com

汪電雷(1977-),男,碩導(dǎo),副教授,藥物代謝動力學(xué)研究,Tel:(0551)5169230,E-mail: dlwang@ahtcm.edu.cn