肝郁脾虛泄瀉大鼠模型的建立及評價

張慶業(yè)，廖小紅，范麗霞，涂星，2，房財富，唐洪梅

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510006; 3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510407)

研究報告

肝郁脾虛泄瀉大鼠模型的建立及評價

張慶業(yè)1，廖小紅1，范麗霞1，涂星1，2，房財富3，唐洪梅1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510006; 3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510407)

目的采用多因素刺激方法建立吻合人類“肝郁脾虛泄瀉”疾病特征的大鼠模型,并選取操作簡單、結(jié)論實(shí)時、科學(xué)經(jīng)濟(jì)的評價指標(biāo)。方法將幼年SD大鼠隨機(jī)分為空白組和模型組,模型組采用母嬰分離、束縛刺激、直腸醋酸刺激三種因素復(fù)合造模,選擇不同時間測定大鼠體重變化、直腸敏感性、大鼠糞便分型積分及糞便含水量等指標(biāo),客觀驗(yàn)證肝郁脾虛泄瀉模型是否成功。結(jié)果模型大鼠出現(xiàn)食欲減退,飲水量增大,尿液減少的病理現(xiàn)象,部分大鼠出現(xiàn)活動增加、甚至躁狂。糞便積分在5～7分,糞便含水量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組大鼠,而腸道敏感性顯著增加。結(jié)論該模型較好的模擬了肝郁脾虛泄瀉的臨床表現(xiàn),能滿足該類疾病的相關(guān)研究。

肝郁脾虛泄瀉;動物模型;母嬰分離;直腸敏感性

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肝屬木,主疏泄,喜條達(dá)而惡抑郁;脾(胃)屬土,主運(yùn)化,脾氣宜清宜升,胃主受納腐熟,胃氣宜降宜和,共同完成機(jī)體對飲食物的消化吸收和輸布功能。若肝失疏泄,脾失運(yùn)化,發(fā)為“肝郁脾虛”,容易引起慢性泄瀉,與西醫(yī)病癥腸易激綜合征(IBS)癥狀相似［1-3］。肝郁脾虛泄瀉可見于許多疾病,如腸易激綜合征、慢性胃炎、消化性潰瘍等,在臨床上的十分常見,如腸易激綜合征在青少年人群中患病率就高達(dá)10%～20%［4］。

國內(nèi)外眾多學(xué)者從肝郁脾虛泄瀉臨床癥狀特點(diǎn)出發(fā)建立了多種模型,取得了一定的成果,但研究中還存在模型的建立與中醫(yī)發(fā)病機(jī)理不完全符合、評價指標(biāo)未能量化表示等問題［5,6］。本研究依據(jù)肝郁脾虛證的發(fā)病學(xué)說,運(yùn)用精神-神經(jīng)-外周刺激三種因素復(fù)合造模法構(gòu)建肝郁脾虛證大鼠模型,模擬出符合肝郁脾虛證候及泄瀉特點(diǎn)的模型,并且通過可量化測定、操作性強(qiáng)的多項(xiàng)指標(biāo)評價模型,使模型可以重復(fù)操作。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物及飼養(yǎng)

初生SPF級SD大鼠4窩(30只),購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(粵)2013-0020】,雄雌不限,與母鼠同籠,第14天后斷奶并與母鼠分籠,在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)環(huán)境下操作【SYXK(粵)2013-0092】,常規(guī)攝食飲水,光照為保持晝夜節(jié)律各12h。溫度控制在18～24℃,相對濕度控制在50%～70%,實(shí)驗(yàn)時室溫維持在24～26℃。

1.2 試劑和儀器

醋酸;乙醚;4%甲醛;靜脈留置管;石蠟油;HE染色液;龍膽紫液;0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4);75%酒精;二甲苯;中性樹膠;生理鹽水; 1 mL、5 mL、10 mL注射器;手術(shù)膠手套;電子秤;血壓計;大鼠血管活性腸肽ELISA檢測試劑盒(含量≥99%,規(guī)格:96T,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

2 模型制作與評價方法

2.1 動物分組和造模［5］

實(shí)驗(yàn)用幼年SD大鼠從出生第2天起開始造模,隨機(jī)分為正常對照組(n=10)、模型組(n=20)。肝郁脾虛泄瀉模型組:SD乳鼠從第1～7天適應(yīng)性飼養(yǎng),從第8～21天,將乳鼠每天取出單獨(dú)小籠飼養(yǎng)2 h,再將乳鼠用乙醚麻醉后,用自制的直腸刺激注射裝置經(jīng)石蠟油潤滑后輕柔地插入肛門,在8～14 d時插入約3 cm,在15～21d時插入約5 cm,每次插入穩(wěn)定后,注入0.5%的醋酸每次0.4 mL/d,注入醋酸后,注射管在腸內(nèi)停留1～2 min,以免醋酸流出。在22～35d時大鼠用紙帶束縛前肩、前上肢及胸部,束縛時間為2 h/d,期間單獨(dú)分離飼養(yǎng),不限活動。正常對照組按相同處理方法直腸注射生理鹽水,不做束縛處理。造模時,幼鼠放置到單獨(dú)的小籠造模,造模完畢后放回與母鼠同籠飼養(yǎng),第42天造模結(jié)束。

2.2 模型的評價及機(jī)理分析

2.2.1 大鼠體重及行為學(xué)評價

記錄大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中飲水、食欲、活動情況等變化,在造模開始的第7、35、42、49、56天進(jìn)行稱量大鼠體重,取三次測試的平均值,比較模型組與對照組大鼠體重情況。

2.2.2 大鼠糞便Bristol分型積分及含水量測定

在造模開始的第35天、第49天、第63天進(jìn)行測試大鼠糞便分型評分,取三輪測試的平均值,并測定糞便含水量,判斷其是否屬于便秘還是腹瀉。糞便測試方法如下:每天將模型大鼠單獨(dú)置于代謝籠內(nèi)4h,測試期間禁水禁食,單獨(dú)靜置,收集4h內(nèi)大鼠的糞便,比較同日齡模型組與空白組幼鼠糞便差異,包括糞便溏稀程度、糞便形狀、糞便顏色改變、有無異物等。并根據(jù)Bristol大便性狀圖譜記錄大便性狀［7］(Bristol大便性狀分型:1型為分離的硬團(tuán),2型為團(tuán)塊狀,3型為干裂的香腸狀,4型為柔軟的香腸狀,5型為軟的團(tuán)塊,6型為泥漿狀,7型為水樣便。其中1、2型為便秘(constipation);3、4型為正常(ideal stools);5、6、7為腹瀉(diarrhea or urgency)。按照中國藥典附錄烘干法測定糞便含水量。

2.2.3 直腸敏感性測試

在造模后的第35天、第49天、第63天對各組幼鼠進(jìn)行大鼠的腹部回縮反射(AWR)測試,將血壓計、針管與自制指套氣囊用三通管連接,用針管向氣囊內(nèi)打氣時可以在血壓計上讀出氣囊內(nèi)壓力。大鼠在自制的密封麻醉瓶進(jìn)行乙醚麻醉后,把用石蠟油潤滑后的氣囊經(jīng)肛門輕柔地插入約3～5 cm,氣囊末端距肛門1 cm,用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起,固定氣囊。大鼠蘇醒后,將其放在特制的不能轉(zhuǎn)身的透明塑料瓶內(nèi)。15 min后待大鼠適應(yīng)環(huán)境,在大鼠意識完全清醒的情況下逐漸打氣擴(kuò)張腸道,分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力閾值,相應(yīng)的AWR腹部有回撤反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)參照Al-Chaer［8］的方法進(jìn)行評分。記錄第2分或第3分的壓力值,當(dāng)大鼠出現(xiàn)1分或4分時,待大鼠充分休息后重新測試。為得到準(zhǔn)確的評估結(jié)果,對每一閾值都重復(fù)進(jìn)行3次擴(kuò)張,數(shù)據(jù)取均值。

2.2.4 結(jié)腸HE染色分析

正常組和模型組大鼠在第42日齡時,將實(shí)驗(yàn)大鼠禁食1d后,腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉處死大鼠,分離直腸和結(jié)腸,剪取乙狀結(jié)腸腸段2cm及近降結(jié)腸處直腸腸段1 cm,水洗凈,浸入5%福爾馬林液中備用。使用脫水機(jī)和包埋機(jī)對大鼠標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋,標(biāo)本用石蠟包埋后,放進(jìn)全自動石蠟切片機(jī)中切片:4℃冰箱預(yù)冷40 min,以鋒利刀片切出1μm的切片,貼附于載玻片上備用。

大鼠的結(jié)腸標(biāo)本完成包埋后,放進(jìn)常規(guī)染色的說明書操作步驟進(jìn)行操作。

2.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間變量比較用t檢驗(yàn),以P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 大鼠體重及行為學(xué)評價

大鼠在造模過程中出現(xiàn)食欲減退,飲水量增大,尿液減少的病理現(xiàn)象,部分大鼠出現(xiàn)活動增加、甚至躁狂的現(xiàn)象。大鼠第7、35、42、49、56天體重情況變化見圖1。由圖1可以看出,模型組大鼠的體重較正常大鼠體重減輕。

圖1 造模過程模型組與正常組大鼠體重變化曲線Fig．1 Curves of body weight changes in rats of the two groups

3.2 大鼠糞便Bristol分型積分及含水量測定結(jié)果

圖2 大鼠糞便分型積分箱式圖Fig．2 Box-plots of the integral classification of rat excrement in the two groups

對第35、49、63天大鼠糞便Bristol分型積分做箱式圖分析,結(jié)果見圖2。由圖2可以看出,造模結(jié)束時(第35天)正常組糞便積分在3.2左右,而模型組糞便積分在5.7左右,表明所建立的模型為腹瀉型。對第35天、第49天、第63天大鼠糞便含水量進(jìn)行測定,測定結(jié)果見表1。由表1可以看出,模型組大鼠的糞便含水量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組的糞便含水量,進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究所建立的模型為腹瀉動物模型。此外,第49天和第63天,模型組大鼠糞便積分能較好的保持在5分以上,即依然保持腹瀉狀態(tài),但是積分值逐漸下降,且糞便含水量也呈現(xiàn)下降趨勢,表明模型組大鼠處于自然恢復(fù)狀態(tài),腹瀉漸漸好轉(zhuǎn),提示造模結(jié)束后4周內(nèi)為最佳的評價和研究階段,可用于肝郁脾虛泄瀉的機(jī)理和治療研究。

表1 第35、49、63天大鼠糞便含水量測定結(jié)果(±s, n=10,%)Tab．1 Water content in the rat feces at days35,49 and 63

表1 第35、49、63天大鼠糞便含水量測定結(jié)果(±s, n=10,%)Tab．1 Water content in the rat feces at days35,49 and 63

注:與正常組相較,※P＜0.05。Note:Compared with the normal group,※P＜0.05.

天數(shù)Days模型組糞便含水量Model group Water content in feces 41.9892±4.8245正常組糞便含水量Normal group Water content in feces 35 53.7682±3.4234※42.1709±4.0823 49 49.9564±5.3427※42.3462±3.8796 63 46.4457±5.7239※

3.3 直腸敏感性測試結(jié)果

在造模后的第35天、第49天、第63天對各組幼鼠進(jìn)行大鼠的腹部回縮反射(AWR)測試,結(jié)果見圖3。由圖3可見,模型組大鼠痛閾值下降,即對疼痛的耐受力下降,表明所建立的動物模型的腸道敏感性升高。

3.4 直腸HE染色結(jié)果分析

正常組的結(jié)腸黏膜表面完整,未見糜爛及潰瘍;黏膜上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量正常;黏膜下層及漿膜層未見水腫及炎細(xì)胞浸潤。模型組的結(jié)腸黏膜表面正常,黏膜下層略有水腫增厚,并有輕度炎癥細(xì)胞浸潤(圖4,見彩插3)。

圖3 正常組與模型組大鼠直腸敏感性評估結(jié)果箱式圖Fig．3 Box-plots of the evaluation of rat rectal sensitivity in the two groups

4 討論

肝郁脾虛證是中醫(yī)臟腑最常見的病理癥候之一。據(jù)統(tǒng)計,中醫(yī)五臟中發(fā)病率最高的是肝臟,占五臟發(fā)病的39.6%,肝郁證及其相兼癥候則占總肝病數(shù)的41.9%［9］。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)來看,涉及神經(jīng)、消化、免疫等多系統(tǒng)功能的改變。本研究在中醫(yī)肝郁脾虛理論的指導(dǎo)下,采取母嬰分離方法造成早期的應(yīng)激反應(yīng),加束縛法聯(lián)合模擬出情志不遂致病的病因病機(jī),結(jié)合醋酸直腸注射造成炎癥后康復(fù)的胃腸功能紊亂而制作出肝郁脾虛泄瀉的動物模型。在一般行為學(xué)觀察中出現(xiàn)食欲減退,飲水量增大,尿液減少的病理現(xiàn)象,部分大鼠出現(xiàn)活動增加、甚至躁狂的現(xiàn)象與人的肝郁脾虛證癥狀有許多相似之處。

本研究中,模型組大鼠糞便分型積分在5～7分,表現(xiàn)為腹瀉癥狀,此外糞便含水量較正常組顯著升高(P＜0.05),表明本研究所制作的為肝郁脾虛泄瀉的動物模型。直腸敏感性評估結(jié)果顯示,以本研究方法所制作的肝郁脾虛泄瀉動物模型的內(nèi)臟敏感性升高,而易出現(xiàn)腹部回縮反射,提示內(nèi)臟高敏性可能是肝郁脾虛泄瀉的發(fā)病機(jī)理之一。

綜上所述,在早期母嬰分離的基礎(chǔ)上,采用束縛應(yīng)激法結(jié)合腹直腸注射醋酸致炎法制作肝郁脾虛泄瀉大鼠模型,較成功的模擬出相關(guān)癥候,為探索肝郁脾虛泄瀉發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ),也為治療其病癥的中藥新藥開發(fā)提供了更加科學(xué)合理的動物模型。但本研究缺乏對該肝郁脾虛泄瀉動物模型進(jìn)行藥物反證,尚有待進(jìn)一步研究和探討。

(本文圖4見彩插3。)

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Establishment and assessment of the diarrhea ratmodel of liver-QI stagnation w ith spleen deficiency

ZHANG Qing-ye1,LIAO Xiao-hong1,FAN Li-xia1,TU Xing1,2,FANG Cai-fu3,TANG Hong-mei1※
(1.the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China; 2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,510006;3.the Affiliated Tumor Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510000)

ObjectiveTo establish a diarrhea ratmodel using multiple-stimulating factors and choosing the best indexes to assesswhether themodel is consistentwith the disease characteristics of liver-QIstagnation with spleen deficiency in traditional Chinesemedicine.M ethodsNewborn SD rats were randomly divided intomodel group(n=20)and control group(n=10).The rats ofmodel group were stimulated bymaternal separation,restraint stress and rectum acetic acid irritation,while the rats in control group were fed as normal.Weight changes,rectal sensitivity,Bristol scores and water content of feces and histology of the colon tissues were used as evaluation indexes to assesswhether themodelmeets the demands for further studies.ResultsThe rats in themodelgroup showed loss of appetite,increase ofwater intake and urine reduction.Some rats showed increased activity,and evenmania.Bristol scores and water contentof feceswere significantly higher than thatof the control group,and the rectal sensitivity was significantly increased.The colonmucosa showed slightly thickened submucosal layer and mild inflammatory cell infiltration in themodel rats.ConclusionsThe ratmodel established in this study is better to simulate the clinicalmanifestation of liver-QIstagnation with spleen deficiency in Chinesemedicine,and maymeet the demands of related researches of this disease.

Liver-QI stagnation with spleen deficiency;Ratmodel;Maternal separation;Rectal sensitivity

Q95-33

A

1005-4847(2014)03-0020-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.004

2013-11-04

國家自然科學(xué)基金(81073160);廣東省自然科學(xué)基金(S2012010010539);廣州中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新基金(11CX027);廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中醫(yī)病機(jī)與治法研究實(shí)驗(yàn)室開放課題(AAF110111A16)。

張慶業(yè),男,主管藥師,碩士,研究方向:臨床藥理學(xué)及治療學(xué)。E-mail:zqy08@139.com,Tel:020-36591293.

唐洪梅,主任中藥師,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:中藥新藥開發(fā)與安全性評價。E-mail:tanghongmei2000@163.com,Tel:020-36598708.