天然促生因子促使黃漿水發(fā)酵條件優(yōu)化

趙貴麗，羅愛平*，廖婭凡，吳紅滿，楊潔，宋志敏

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025)

黃漿水主要來自熱豆?jié){凝固、制坯壓榨出來的泔水。黃漿水中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及多種對(duì)人體健康有特殊功能作用的生理活性物質(zhì)，如大豆異黃酮等[1-5]。但黃漿水中有機(jī)物含量低，培養(yǎng)所得生物量和產(chǎn)酸量有限，因此，需要加入一定量的營養(yǎng)物質(zhì)以提高其生物量和產(chǎn)酸量[6]。面粉、糯米粉、大米粉、玉米粉不僅含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)物，還含有礦物元素及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，且來源廣泛，價(jià)格便宜，故利用這些天然促生因子與黃漿水有機(jī)結(jié)合、營養(yǎng)互補(bǔ)來滿足微生物的正常生長繁殖[7-10]。研究通過添加天然促生因子促使黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出最佳天然促生因子，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件及最佳天然促生因子添加量，研制一種豆腐天然凝固劑。不僅滿足人們?cè)陲嬍撤矫孀非蟆熬G色”、追求“天然”的理念，也減輕企業(yè)治污和推動(dòng)社會(huì)效應(yīng)，增加大豆加工附加值[11-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黃漿水：將大豆進(jìn)行精選、除雜、清洗后，用三倍于大豆（重量比）的自來水于室溫（25-28℃）下浸泡8-10h，瀝干后，用8倍于大豆干重的自來水于磨漿機(jī)進(jìn)行磨漿，將所得豆?jié){用120目濾布進(jìn)行過濾，并將濾出豆?jié){加熱至95℃，保持5min。待豆?jié){冷卻到80℃，量取1000mL熟豆?jié){于不銹鋼盆中，將盆放入80℃的恒溫水浴中，然后將30mL0.5M的氯化鎂溶液，緩慢加入熟豆?jié){中，并輕輕攪拌，直至豆?jié){凝固物出現(xiàn)停止攪拌，保溫靜置20min后破腦壓制得到的黃漿水；貴州中意食品有限責(zé)任公司提供。 面粉（80粉）、糯米粉、大米粉、玉米粉，購于貴陽市花溪區(qū)合力超市。 葡萄糖：購于保齡寶生物股份有限公司。氫氧化鈉等：分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司。

LRH系列生化培養(yǎng)箱 上?！憧萍加邢薰?；CS202B型電熱保溫干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SZ-96型自動(dòng)純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C酸度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 新鮮黃漿水中加入4 %（w/v）的葡萄糖，調(diào)整初始pH為 6.2，37 ℃自然發(fā)酵24 h，即為種子液，備用。1.2.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 天然促生因子的篩選 在黃漿水中分別添加4%（w/v）的面粉 、玉米粉 、糯米粉、大米粉，80 ℃水浴5min進(jìn)行糊化，待冷卻后，調(diào)整初始pH 6.2，接種6%（v/v）種子液，37 ℃培養(yǎng)24 h，并以常用碳源葡萄糖及空白為對(duì)照，以產(chǎn)酸量和pH為考察指標(biāo)，篩選最佳促黃漿水自然發(fā)酵的天然促生因子。

1.2.2.2 發(fā)酵條件的篩選 固定發(fā)酵溫度37℃、接種量6%（v/v）、最佳天然促生因子添加量4%（w/v）、發(fā)酵時(shí)間24h、培養(yǎng)基初始pH 6.2。在其它條件不變的前提下，分別改變發(fā)酵溫度27、30、34、37、42℃，接種量3%、6%、9%、12%、15%，最佳天然促生因子添加量0%、2%、4%、6%、8%、10%，發(fā)酵時(shí)間24、48、72、96、120h，以產(chǎn)酸量、pH為指標(biāo)，考察四因素對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響。

1.2.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)黃漿水自然發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。以發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）、最佳天然促生因子添加量（X4）四個(gè)因素為自變量，以產(chǎn)酸量為Y，利用DPS軟件設(shè)計(jì)4因素5水平10個(gè)試驗(yàn)處理的U10（54）均勻試驗(yàn)[15-17]，因素水平見表1。

表1 U10（54）均勻設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 U10（54）Variables and levels in the uniform design

1.2.4 測(cè)定指標(biāo) 產(chǎn)酸量的測(cè)定[18]:取5mL發(fā)酵液至250mL的三角瓶中，加入25 mL蒸餾水，再加2滴0.1%的酚酞，搖勻，用0.0l mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30s不褪色即為終點(diǎn)。

式中：C- NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)； V-滴定待測(cè)樣消耗 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；V0-滴定原樣消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)； m-取樣量(mL)； K-酸換算系數(shù)，用乳酸表示，K=0.090。

pH：采用PHS-3C酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件IBM SPSS Statistics v19.0.0進(jìn)行顯著性分析。折線圖采用OriginPro 8.5繪圖軟件繪制。均勻試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同天然促生因子對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響

圖1 天然促生因子對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響Fig. 1 The result of different natural growth-promoting factors to ferment yellow serofluid

圖1可知，空白組pH為4.01，葡萄糖組pH為3.58，面粉組pH為3.45，故在黃漿水中添加面粉時(shí)pH最低，即酸性最強(qiáng)。

黃漿水中添加面粉的產(chǎn)酸量最高為0.6251g/100mL，是葡萄糖組0.5742g/100mL的1.09倍，是空白組0.3042g/100mL的2.05倍。表明添加面粉能較好的促進(jìn)黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量顯著高于其余各組（p<0.05），故面粉為最佳天然促生因子。結(jié)果表明，黃漿水中添加面粉時(shí)產(chǎn)酸量最高，pH最低，且其來源廣泛，價(jià)格便宜，故面粉為最佳天然促生因子。

2.1.2 不同面粉添加量對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響

圖2 面粉添加量對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響Fig. 2 The result of different additive amount of flour to ferment yellow serofluid

由圖2可知，未添加面粉時(shí)，pH達(dá)最大值，產(chǎn)酸量達(dá)最小值；當(dāng)面粉添加量為8%時(shí)，pH達(dá)到最低值，產(chǎn)酸量達(dá)最高值。

當(dāng)面粉添加量由0升至2%時(shí)，產(chǎn)酸量顯著上升，表明添加面粉能夠促進(jìn)黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸；面粉添加量為8%時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最大為0.7545g/100mL是未添加面粉組最小值0.3042g/100mL的2.48倍；當(dāng)面粉添加量為8～10%時(shí)，產(chǎn)酸量呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著面粉添加量增加，產(chǎn)酸菌生長速度加快，產(chǎn)酸量增加，使環(huán)境pH下降，抑制菌體的生長。同時(shí)當(dāng)面粉添加量到一定濃度時(shí)，環(huán)境的滲透壓增加，使菌體生長受到抑制甚至不能忍受高滲環(huán)境死亡。結(jié)果表明：添加面粉對(duì)黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸影響顯著（p<0.05）；面粉添加量以8%為宜。

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響Fig. 3 The result of different temperature to ferment yellow serofluid

由圖3可知，pH隨發(fā)酵溫度的升高呈先下降后上升趨勢(shì)；產(chǎn)酸量隨發(fā)酵溫度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)。

當(dāng)發(fā)酵溫度為 27～37℃時(shí)，產(chǎn)酸量隨發(fā)酵溫度的升高而升高；37℃時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最大值 0.6077 g/100mL，比27℃組最小值0.3507g/100mL提高73.28%，表明37℃適宜黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量顯著高于其余各組（p<0.05）；當(dāng)溫度由 37℃升至 42℃時(shí)，產(chǎn)酸量顯著降低，這是由于溫度過高，抑制產(chǎn)酸菌的生長所致。結(jié)果表明，37℃是黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳培養(yǎng)溫度。

2.1.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響Fig. 4 The result of different time to ferment yellow serofluid

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由24h升至48h時(shí)，pH緩慢下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，pH達(dá)到最低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48～120 h，pH隨發(fā)酵時(shí)間的延長而顯著上升。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由24h延長至48h時(shí)，產(chǎn)酸量顯著上升；發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)最大值0.7254g/100mL是120h組最小值0.1026g/100mL的7.07倍，顯著高于其余發(fā)酵時(shí)間組（p<0.05）；隨后產(chǎn)酸量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而顯著降低，這是因?yàn)榘l(fā)酵后期腐敗菌導(dǎo)致產(chǎn)酸量下降所致，表明適宜發(fā)酵時(shí)間可以促進(jìn)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸。結(jié)果表明，黃漿水自然發(fā)酵時(shí)間以48h為宜。

2.1.5 不同接種量對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響

圖5 接種量對(duì)黃漿水自然發(fā)酵的影響Fig. 5 The result of different inoculum size to ferment yellow serofluid

由圖5可知，接種量為3%～6%時(shí)，隨接種量的增加，黃漿水pH降低；接種量為6%時(shí)，pH達(dá)到最低為3.61；接種量為6%～15%時(shí)，隨接種量的增加pH升高；接種量為15%時(shí)，pH達(dá)到最高。

接種量由3%升至6%時(shí)，黃漿水產(chǎn)酸量緩慢升高；接種量為6%時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最高為0.5063g/100mL是最小值15%組0.2256g/100mL的2.24倍，表明黃漿水接種量為6%時(shí)適宜黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量顯著高于其余各組（p<0.05）；接種量6%～15%，隨接種量的增加產(chǎn)酸量降低。結(jié)果表明，接種量以6%為宜。

2.2 均勻試驗(yàn)結(jié)果與分析

由單因素結(jié)果可知，黃漿水中添加面粉時(shí)產(chǎn)酸量最高，pH最低，表明添加面粉能較好的促進(jìn)黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸，并且面粉是最常見的食品原料之一，故選擇面粉為最佳天然促生因子。均勻設(shè)計(jì)U10（54）結(jié)果見表2。

表2 U10（54）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 U10（54）The results of uniform design experiments

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=1.9441-0.0441X1-9.8839X2-0.0076X3+2.6791X4+0.0005X12+46.9041X22+0.00004X32+5.6626X42

根據(jù)相關(guān)系數(shù)R=94.89%,剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.0927，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度很高，能很好的擬合黃漿水自然發(fā)酵條件。

經(jīng)DPS軟件二次多項(xiàng)式逐步回歸，得出最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素組合為：X1=37.08，X2=0.03，X3=24.18，X4=0.075，即發(fā)酵溫度為37.08℃，接種量為3%(v/v)，發(fā)酵時(shí)間為24.18h，面粉添加量為7.5%(w/v)，此時(shí)產(chǎn)酸量得率最高為0.8537g/100mL。為便于生產(chǎn)應(yīng)用，調(diào)整黃漿水自然發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37℃，接種量3%(v/v)，發(fā)酵時(shí)間 24h，面粉添加量 7.5%(w/v)。按照上述條件進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得產(chǎn)酸量為0.8301g/100mL，達(dá)到回歸預(yù)測(cè)理論值（0.8537g/100mL）的97.24%，表明最佳發(fā)酵條件可靠。

3 討論與結(jié)論

3.1 由于制作豆腐時(shí)加工條件不同、使用凝固劑不同等原因，導(dǎo)致產(chǎn)生的黃漿水pH不盡相同。酸漿中主要是乳酸菌產(chǎn)酸，適宜乳酸菌生長的MRS培養(yǎng)基初始pH為6.2±0.2，故將黃漿水初始pH統(tǒng)一調(diào)整為6.2。

3.2 通過比較4種天然促生因子對(duì)黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸的研究，面粉為最佳天然促生因子。面粉添加量為4%時(shí)，其產(chǎn)酸量為0.6251g/100mL，是葡萄糖0.5742g/100mL的1.09倍，空白0.3042 g/100mL的2.05倍，表明添加面粉能較好的促進(jìn)黃漿水發(fā)酵產(chǎn)酸。

3.3 將生物培養(yǎng)基中的常規(guī)碳源葡萄糖與天然促生因子碳源進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性比較，表明面粉是一種來源廣泛，價(jià)廉物美，經(jīng)濟(jì)性良好，能有效促使黃漿水自然發(fā)酵的天然促生因子。

3.4 均勻試驗(yàn)優(yōu)化黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37 ℃，接種量3%(v/v)，發(fā)酵時(shí)間24h,面粉添加量7.5%(w/v)，培養(yǎng)基初始pH 6.2，產(chǎn)酸量達(dá)0.8301g/100mL；比單一黃漿水自然發(fā)酵產(chǎn)酸量0.3042 g/100mL提高2.73倍，明顯提高了黃漿水自然發(fā)酵的產(chǎn)酸量。

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