粘質(zhì)沙雷氏菌的分離鑒定及產(chǎn)紅色素培養(yǎng)基的優(yōu)化

季秀玲，林連兵，張 琦，魏云林

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

很多天然色素安全可靠、沒有毒副作用，色調(diào)自然，接近天然物質(zhì)，其中很多品種均具有生理活性，如β-胡蘿卜素在抗癌、預(yù)防心血管疾病及白內(nèi)障上有顯著功能，因此開發(fā)天然色素是國際上研究的重點(diǎn)。

靈菌紅素是具有三個(gè)吡咯環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的天然紅色素，具有抗細(xì)菌、真菌、瘧疾和霉菌、抗病毒、免疫抑制和抗腫瘤等作用[1-4]。作為一種新的天然抗癌待選藥物，靈菌紅素已逐漸成為國內(nèi)外癌研究的熱點(diǎn)之一[5-7]；而微生物發(fā)酵生產(chǎn)的靈菌紅素更是比較理想的天然色素，因此該色素具有很好的應(yīng)用前景。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展和對靈菌紅素的深入研究，靈菌紅素的產(chǎn)生和作用機(jī)制將會被更加清晰地認(rèn)識，大量制備，并應(yīng)用于免疫治療以造福于人類。

本文從昆明冶煉廠廢水中篩選得到一株產(chǎn)紅色素的KMR-3菌株，對其形態(tài)特征、生理生化鑒定以及基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行了研究，并以KMR-3為出發(fā)菌株，對其產(chǎn)紅色素的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過全波長掃描，初步確定紅色素為靈菌紅素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白胨、酵母膏、NaCl 分析純，天津化學(xué)試劑三廠；pMD18-T載體、T4 DNA連接酶（經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色檢測其純度大于95%） TaKaRa大連寶生物。

PCR擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；UV1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWY-1102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國BIORAD公司；Sigma 1-14離心機(jī) 德國Sigma公司；細(xì)菌生化微量鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 KMR-3菌株的分離 采集云南省昆明冶煉廠周圍的廢水，水溫15℃，pH5.0左右。將采集到的樣品經(jīng)濾紙過濾，取2mL濾液于100mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，15℃，150r/min培養(yǎng)24h。吸取10μL富集培養(yǎng)的混合菌液，稀釋10倍、100倍、1000倍涂布LB平板（Φ＝9cm）：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。15℃，150r/min培養(yǎng)24h，然后挑取不同單菌落于LB平板上劃線分離純化，獲得單菌落。

1.2.2 生理生化特性

1.2.2.1 KMR-3菌落及菌體形態(tài)的觀察 吸取20μL新鮮培養(yǎng)的KMR-3菌液，稀釋不同倍數(shù)，涂布于LB固體平板上，15℃培養(yǎng)2d，觀察KMR-3菌株菌落形態(tài)；革蘭氏染色觀察KMR-3菌體形態(tài)。

1.2.2.2 生長溫度對KMR-3菌株產(chǎn)紅色素影響 涂布10μL新鮮培養(yǎng)的KMR-3菌液于LB固體平板上，分別置于4、15、28、37、42℃培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長狀況及溫度對色素產(chǎn)生的影響。

1.2.2.3 生長pH對KMR-3菌株產(chǎn)紅色素的影響 接種10μL新鮮培養(yǎng)的KMR-3菌液于不同pH（1～14）的5mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃，150r/min，培養(yǎng)24h，觀察菌體生長pH范圍。

1.2.2.4 生理生化特征鑒定[8]KMR-3菌株于28℃，150r/min，培養(yǎng)12h，取5μL新鮮培養(yǎng)液接種于細(xì)菌生化微量鑒定管內(nèi)，28℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。鑒定項(xiàng)目有：糖醇類的氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇）、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)、尿素實(shí)驗(yàn)、丙二酸鹽實(shí)驗(yàn)、側(cè)金盞花醇實(shí)驗(yàn)、葡萄糖磷酸鹽胨水實(shí)驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 分子生物學(xué)分類鑒定 利用16S rRNA基因的一對通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：f15′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，r25′-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測后，與pMD18-T載體連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，涂布含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板，置于37℃培養(yǎng)12h。通過T載體的通用引物M13（RV/M4）檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增驗(yàn)證的產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志公司測序部進(jìn)行雙向測序，序列提交GenBank，通過Blast進(jìn)行序列同源性檢索分析。利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定KMR-3菌株的分類學(xué)地位。

1.2.4 紅色素全波長掃描 將制得的色素樣品溶解在酸性甲醇溶液中，在200～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描[9-10]。

1.2.5 色素產(chǎn)量的評定 KMR-3菌株發(fā)酵溫度為28℃，pH為5.0。對不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液取樣，通過離心取上清測定OD535值初步評估色素產(chǎn)量。

1.2.6 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.2.6.1 不同培養(yǎng)基的確定 以LB液體培養(yǎng)基作為起始培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基的優(yōu)化（不含胰蛋白胨、不含酵母粉和不含NaCl的LB改良培養(yǎng)基）見表1中的LB-1、LB-2和LB-3，分別于0、6、12、24、36、48、60、72和90h對發(fā)酵液取樣，離心取上清測定OD535值。

1.2.6.2 胰蛋白胨添加量的確定 以只含胰蛋白胨（5、10、15g/L）的液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，見表1中的LB-4、LB-5和LB-6，發(fā)酵液取樣時(shí)間同1.2.6.1，離心取上清測定OD535值。

1.2.6.3 甘油添加量的確定 以5g/L胰蛋白胨和0.5%、1%和2%甘油的液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，見表1中的LB-7、LB-8和LB-9，發(fā)酵液取樣時(shí)間同1.2.6.1，離心取上清測定OD535值。

表1 產(chǎn)紅色素培養(yǎng)基的組成Table 1 Compositions of media used for production of red pigment

2 結(jié)果與討論

2.1 KMR-3菌株的分離篩選

從冶煉廠周圍的廢水中分離到14株不同的細(xì)菌，其中KMR-3菌株能夠產(chǎn)生紅色素（圖1）。因此對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rRNA基因分析。

圖1 KMR-3菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphological character of KMR-3 strain

2.2 KMR-3菌株的菌落及菌體形態(tài)

KMR-3菌株在LB平板上，15℃培養(yǎng)2d，菌落產(chǎn)生紅色素，菌落直徑約2mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑，較粘稠，易挑起（圖1），菌體革蘭氏染色為陰性、該菌菌體細(xì)胞為短桿狀，端圓。

2.3 生理生化特征

2.3.1 生長溫度對產(chǎn)紅色素影響 KMR-3菌株能在4、15、28、37℃培養(yǎng)條件下生長，在42℃不生長（表2）；4～28℃培養(yǎng)產(chǎn)生紅色色素，但37℃培養(yǎng)不產(chǎn)生色素，而把培養(yǎng)溫度從37℃降低到28℃培養(yǎng)又可產(chǎn)生紅色色素[11]，這與沙雷氏菌的特征很相近。而沙雷氏菌屬中有3個(gè)種可以產(chǎn)生靈菌紅素，分別為粘質(zhì)沙雷氏菌、深紅沙雷氏菌和普城沙雷氏菌。因此還需通過其他的生理生化特征進(jìn)行進(jìn)一步地鑒定。

表2 不同溫度條件下KMR-3生長狀況及產(chǎn)色素情況Table 2 Growth and pigment of KMR-3 at different temperatures

2.3.2 生長pH對產(chǎn)紅色素影響 KMR-3菌株能在pH4～10范圍的LB液體培養(yǎng)基中生長，且均產(chǎn)生紅色素（表3），其中在pH5.0附近生長最快，初步認(rèn)定為該菌的最適生長pH。

表3 KMR-3菌體生長pHTable 3 Growth of KMR-3 at various pH

2.3.3 菌株生理生化特征鑒定 KMR-3菌株能以葡萄糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、丙二酸鹽和西蒙氏枸櫞酸鹽作為唯一碳源生長，不能以乳糖和衛(wèi)矛醇作為唯一碳源生長，不能利用尿素，不能產(chǎn)生H2S，賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)為陽性（表4）。因此，通過生理生化特征進(jìn)一步表明，KMR-3菌株與已報(bào)道的粘質(zhì)沙雷氏菌特性一致[12]，因此KMR-3菌株屬于粘質(zhì)沙雷氏菌。

表4 KMR-3菌株生理生化特征Table 4 Physiological characteristics of KMR-3 strain

2.4 KMR-3菌株分子生物學(xué)鑒定

KMR-3菌株16S rRNA基因序列全長為1505bp，GenBank登錄號（Accession Number）為DQ629026.1。經(jīng)NCBI Blastn分析，表明其與Serratia marcescens同源性最高，達(dá)99.9%，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

圖2 KMR-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain KMR-3 and its relatives

從系統(tǒng)進(jìn)化樹可看出，KMR-3菌株與Serratia屬中的各菌株歸于同一簇群。因此，依據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將其鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的一個(gè)菌株。KMR-3在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacteriales；Enterobacteriaceae；Serratia；Serratia marcescens。

2.5 紅色素全波長掃描

色素樣品在酸性條件下的最大吸收波長為535nm（圖3），與靈菌紅素的吸收波長一致，由此初步確定該色素為靈菌紅素[13-15]。

圖3 紅色素的全波長掃描圖譜Fig.3 Full wavelength scanning of red pigment

2.6 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.6.1 不同培養(yǎng)基的確定 不同培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵液取樣、離心取上清測定OD535值初步評估色素產(chǎn)量（圖4）。結(jié)果表明：發(fā)酵12h時(shí)，不含NaCl的LB-3培養(yǎng)基產(chǎn)色素能力較強(qiáng)，出現(xiàn)一個(gè)小的峰值；而發(fā)酵至48h時(shí)不含酵母粉的LB-2培養(yǎng)基產(chǎn)色素能力最強(qiáng)。因此采用不含酵母膏和NaCl即只含不同濃度胰蛋白胨的培養(yǎng)基（LB-4、LB-5和LB-6）進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同培養(yǎng)基組分對色素產(chǎn)量影響Fig.4 Effect of different mediums on the yield of the red pigment

2.6.2 胰蛋白胨添加量的確定 不同培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵液取樣、離心取上清測定OD535值初步評估色素產(chǎn)量（圖5）。結(jié)果表明：發(fā)酵36h時(shí)，與起始LB培養(yǎng)基相比，含5g/L胰蛋白胨的LB-4培養(yǎng)基產(chǎn)色素能力提高2倍，而10g/L和15g/L胰蛋白胨的LB-5和LB-6培養(yǎng)基產(chǎn)色素能力反而降低（圖5）。因此，以LB-4培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同蛋白胨含量對色素產(chǎn)量影響Fig.5 Effect of different tryptone content on the yield of the red pigment

2.6.3 甘油添加量的確定 針對粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素培養(yǎng)基的配方的研究表明：對產(chǎn)色素來說，醇類物質(zhì)如甘露糖、甘油、乙醇等是常用的碳源[16]。因此以甘油作為碳源優(yōu)化了培養(yǎng)基。

不同時(shí)間對發(fā)酵液取樣、離心取上清測定OD535值評估色素產(chǎn)量（圖6），結(jié)果表明以5g/L胰蛋白胨和1%甘油的LB-8培養(yǎng)基產(chǎn)色素能力最強(qiáng)，是起始LB培養(yǎng)基的13.4倍。

目前對于粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素的研究集中于高產(chǎn)菌種的獲得和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化方面，以提高該天然色素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。例如Tao Jinli等通過補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式提高靈菌紅素的產(chǎn)量[17]；Wei Yuhong等添加氨基酸的方式提高SS-1菌株靈菌紅素產(chǎn)量[18]；韋鳳等分離到一株Sm-128菌株，靈菌紅素粗品產(chǎn)量達(dá)到475mg/L[19]；郝名慧等分離獲得H31菌株并確定最優(yōu)的碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為蔗糖、牛肉膏和CaCl2，最終發(fā)酵液中靈菌紅素的OD535達(dá)到142.638[14]。本研究通過優(yōu)化LB培養(yǎng)基組份及及含量，提高了KNR-3菌株產(chǎn)色素能力。

圖6 不同甘油濃度對色素產(chǎn)量影響Fig.6 Effect of different concentrations of glycerol on the yield of the red pigment

3 結(jié)論

從昆明冶煉廠廢水中篩選得到一株產(chǎn)紅色素的KMR-3菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析將其初步鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌。通過優(yōu)化LB液體培養(yǎng)基不同組分及含量，表明5g/L胰蛋白胨和1%甘油的液體培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基，其產(chǎn)色素能力是起始LB培養(yǎng)基的13.4倍。該培養(yǎng)基不僅具有安全性和蛋白用量少的特點(diǎn)，而且促進(jìn)粘質(zhì)沙雷氏菌快速產(chǎn)生大量紅色素，適用于現(xiàn)代生物工程中細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物發(fā)酵、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基和開發(fā)天然色素等領(lǐng)域。

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