選擇離子氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

孟 穎，閆 璐，胡 潔，王皓銘，王思佳，李爭(zhēng)春，胡永鋼，張生萬(wàn)，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原030006）

焦糖色素是一種世界廣泛使用的食品色素，占整個(gè)食品著色劑使用量的90%以上[1]，由于它的色澤，口感和良好的穩(wěn)定性，被廣泛的用于食醋、醬油、飲料和啤酒等食品中[2]?，F(xiàn)在市場(chǎng)上廣泛使用的焦糖色素多為氨（銨）法生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生一定量的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[3]。有研究表明，4-甲基咪唑有類似吡啶、吡咯的毒性，抑制細(xì)胞色素P450同功酶，它在人的肝臟中發(fā)生催化反應(yīng)，產(chǎn)生許多低分子質(zhì)量的致癌物[4]。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑?qū)偻之悩?gòu)體[5]，能誘發(fā)動(dòng)物驚厥[3]還會(huì)導(dǎo)致甲狀腺腫瘤[6]。世界衛(wèi)生組織和我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 8871-2001均規(guī)定氨（銨）法生產(chǎn)的焦糖色素中4-甲基咪唑的含量不得超過0.02%，而未對(duì)2-甲基咪唑的含量做出規(guī)定[7-8]。為了提供一個(gè)控制食品質(zhì)量與安全的有力依據(jù)，建立快速有效的檢測(cè)食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的方法極其重要。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的薄層色譜法[8]、分光光度法[9]、氣相色譜法[10]是對(duì)焦糖色中的4-甲基咪唑進(jìn)行檢測(cè)；高效液相色譜法[11]對(duì)飲料中的4-甲基咪唑進(jìn)行檢測(cè)；氣質(zhì)聯(lián)用法[1-2，4，7]分別對(duì)液態(tài)調(diào)味料、軟飲料、焦糖色和炭燒咖啡中的4-甲基咪唑進(jìn)行檢測(cè)。用選擇離子（SIM）氣質(zhì)聯(lián)用色譜法同時(shí)測(cè)定食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法在國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文對(duì)各類色譜條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，并對(duì)市售食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2-甲基咪唑、4-甲基咪唑 分析純，西亞試劑；N-甲基甲酰苯胺 分析純，TCI公司；二氯甲烷（分析純）、氫氧化鈉（分析純） 天津市進(jìn)豐化工有限公司；硅藻土 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；食醋市售。

Agilent 7890-5975C型GC/MS聯(lián)用儀 配有電子轟擊離子源（EI），美國(guó)Agilent公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司；BS 124S型分析天平 Satrorius公司；玻璃層析柱（30mm×300mm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 稱取N-甲基甲酰苯胺0.0506g，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解后定容，搖勻，得濃度為1.01mg/mL的儲(chǔ)備液；取1.25mL濃度為1.01mg/mL的溶液至50mL容量瓶，定容后搖勻，得濃度為25.3μg/mL的溶液，備用。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制 分別稱取2-甲基咪唑和4-甲基咪唑0.0504g，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解后定容，搖勻，得濃度為1.01mg/mL的儲(chǔ)備液；取2.50mL濃度為1.01mg/mL的儲(chǔ)備液至25mL容量瓶，用二氯甲烷定容后搖勻，得濃度為101μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

1.2.2 樣品前處理 先取25.0mL樣品于50mL燒杯中，用10mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至11，加入硅藻土30g與樣品混合至半干，將混合物裝入有活塞的層析柱。加入50mL二氯甲烷靜置30min。用150mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2～3mL。轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加入1mL濃度為25.3μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，定容。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：RTX-WAX（30m×250μm×0.5μm）；載氣：He；恒流，柱流量：1.5mL/min；分流進(jìn)樣，分流比：2∶1；進(jìn)樣量：2μL；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱初溫：120℃，保持3min，以15℃/min的速度升至230℃，保持30min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度250℃；四級(jí)桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；溶劑延遲時(shí)間4min；掃描方式選擇離子掃描模式（SIM）；4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的特征離子都為m/z82和54.1，以m/z82為定量離子；N-甲基甲酰苯胺的特征離子為m/z135和106，以m/z135為定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別選擇RTX-WAX、HP-5不同極性的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖1為RTX-WAX色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得色譜圖。結(jié)果表明：選用RTX-WAX極性柱響應(yīng)值較高且峰形好，2-甲基咪唑、4-甲基咪唑完全分離。

圖1 RTX-WAX色譜柱實(shí)驗(yàn)所得總離子流色譜圖Fig.1 The Total ion chromatogram of experiments by RTX-WAX column

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

分別選擇咪唑[4，7]、2-乙基咪唑[2，4，7]和N-甲基甲酰苯胺不同的內(nèi)標(biāo)物在相同的色譜條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：咪唑與4-甲基咪唑出峰時(shí)間相同，無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離；2-乙基咪唑與2-甲基咪唑雖然達(dá)到分離，但分離效果不理想；N-甲基甲酰苯胺不僅出峰快，峰形好，而且與被測(cè)組分達(dá)到完全分離，因此選用N-甲基甲酰苯胺為內(nèi)標(biāo)物。

圖2 不同內(nèi)標(biāo)物與被測(cè)物的總離子流色譜圖Fig.2 The total ion chromatogram of different internal standards and analytes

2.3 GC-MS離子對(duì)的選擇

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑?qū)儆谕之悩?gòu)體，對(duì)其進(jìn)行全掃描，質(zhì)譜圖見圖3，通過全掃描確定化合物的特征離子有m/z82.0、54.1。以m/z82.0作為2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定量離子，以m/z54.1作為2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定性鑒別離子。對(duì)N-甲基甲酰苯胺進(jìn)行全掃描，質(zhì)譜圖見圖4，確定其特征離子有m/z135.0和106.0。以m/z135.0作為N-甲基甲酰苯胺的定量離子，以m/z106.0作為其定性離子。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別精確移取2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)液0.03、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50mL置于10mL容量瓶中，各加入1.00mL濃度為25.3μg/mL的內(nèi)標(biāo)液，定容搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)液，其中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑濃度分別為0.303、0.505、1.01、5.04、10.1、15.2μg/mL，在選擇離子模式下（SIM）平行測(cè)定三次，以被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的線性回歸方程分別為：y=0.2263x-0.0382，R=0.9997和y=0.194x-0.047，R=0.9996，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖3 2-甲基咪唑（a）和4-甲基咪唑（b）的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrum of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

圖4 N-甲基甲酰苯胺的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrum of N-methyl-formanilide

圖5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

結(jié)果表明，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在0～15.2μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；按3倍信噪比計(jì)算2-甲基咪唑、4-甲基咪唑檢出限分別為0.0106、0.0160μg/mL，表明該方法具有較高的靈敏度。

2.5 精密度

在1.2.3項(xiàng)的條件下，對(duì)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑濃度均為5.05μg/mL的溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表1。從表1可知，以峰面積計(jì)算2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%和3.1%，表明該方法精密度良好。

2.6 回收率

精密移取已知2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的樣品3份，置于5mL容量瓶中，分別向其中準(zhǔn)確加入10.1μg/mL的溶液0.50、0.70、0.90mL，每份2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的加入量均分別為5.05、7.06、9.07μg，再各加入0.5mL 25.3μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，定容搖勻，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的平均回收率分別為101.3%和99.3%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。

2.7 樣品測(cè)定

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of RSD by SIM-GC/MS

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率結(jié)果Table 2 Recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole by SIM-GC/MS

分別對(duì)5種市售樣品按1.2.2項(xiàng)的方法處理，在1.2.3項(xiàng)的條件下進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果見圖6、表3。

圖6 樣品的選擇離子色譜圖Fig.6 The selected ion mass spectrum of the sample

表3 樣品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的測(cè)定結(jié)果Table 3 The measurement results of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the sample

由圖6可知，市售的食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均有檢出，計(jì)算各樣品中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量，2-甲基咪唑的含量在0.210～0.850mg/L，4-甲基咪唑的含量在0.776～1.672mg/L范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本文建立了選擇離子氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定食醋中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的新方法。結(jié)果表明：2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的線性范圍均在0～15.2mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9997和0.9996；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%和3.1%；2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的平均回收率分別為101.3%和99.3%。該法具有高靈敏度，定量準(zhǔn)確度更高等優(yōu)點(diǎn)。本法用于市售食醋的分析，取得了滿意結(jié)果。

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