撫順西露天油頁巖可培養(yǎng)微生物的分離與鑒定

蔣紹妍,王文星,薛向欣*

(1.東北大學冶金資源與生態(tài)環(huán)境研究所,遼寧 沈陽110819；2.遼寧省冶金資源循環(huán)科學重點實驗室,遼寧 沈陽110819；3.東北大學生命科學與健康學院,遼寧 沈陽110819)

撫順西露天油頁巖可培養(yǎng)微生物的分離與鑒定

蔣紹妍1,2,王文星3,薛向欣1,2*

(1.東北大學冶金資源與生態(tài)環(huán)境研究所,遼寧 沈陽110819；2.遼寧省冶金資源循環(huán)科學重點實驗室,遼寧 沈陽110819；3.東北大學生命科學與健康學院,遼寧 沈陽110819)

為了解油頁巖中可培養(yǎng)微生物的多樣性,利用稀釋平板培養(yǎng)法對我國撫順盆地西露天組油頁巖中可培養(yǎng)微生物進行分離純化,并對所獲菌株進行16S rDNA(細菌)和rDNA ITS(真菌)序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析.以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離到8株細菌,以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分離到4株真菌.16S rDNA 序列測定結(jié)果表明細菌菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus),短桿菌屬(Brevibacillus),類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)和紅球菌屬(Rhodococcus); rDNA ITS序列測定結(jié)果顯示真菌菌株分別屬于芽枝霉屬(Cladosporium),曲霉屬(Aspergillus),犁頭霉屬(Absidia)和正青霉屬(Eupenicillium).2株細菌(ZK4和ZK5)能夠在以油頁巖為唯一碳源和氮源的固體培養(yǎng)基上連續(xù)生長5代以上,且長勢良好, 可作為油頁巖生物轉(zhuǎn)化的潛力菌株進行深入研究.

油頁巖；微生物多樣性；16S rDNA；rDNA ITS；系統(tǒng)發(fā)育分析

油頁巖是一種富含有機質(zhì)、具有微細層理、可以燃燒的細粒沉積巖[1].我國已探明油頁巖所含的頁巖油地質(zhì)儲量達289.9億t (按平均含油率6%計算),已超過到目前為止累計探明的天然氣和石油儲量的總和,被稱為21世紀的接替能源[2].微生物是重要的生物資源和基因資源[3].微生物轉(zhuǎn)化技術在油頁巖領域的研究尚屬起步階段,相關報道不多,主要是利用生物催化作用浸提油頁巖中的礦物組分[4-6],或利用生物表面活性劑驅(qū)提頁巖油[7],為了加快這一技術的應用步伐,對油頁巖中可培養(yǎng)本源微生物的全面分離與鑒定是一個基礎性的前提,因為一般用于轉(zhuǎn)化礦物的微生物都是先從礦物表面或周圍環(huán)境中分離出來,再進行馴化、培育和遺傳學方面的改造,提高其環(huán)境耐受力和轉(zhuǎn)化率.Matlakowska等[8]曾利用黑頁巖作為唯一碳能源,成功培養(yǎng)了8株從波蘭Lubin銅礦中分離得到的細菌,并利用16S rDNA同源性對比,鑒定其中4株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、1株屬于不動菌屬(Acinetobacter)、1株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、2株屬于微桿菌屬(Microbacterium),并且認為這些本源微生物具有降解黑頁巖中芳香烴以及長鏈脂肪烴的能力[9].此外,有報道稱 Dechloromonas、Comamonas和Clostridium同樣能夠以黑頁巖中干酪根作為唯一的碳能源,并且它們在新陳代謝過程中表現(xiàn)出了多種不同的呼吸和發(fā)酵模式:好氧和厭氧類型異養(yǎng)微生物,如硫酸鹽還原菌和發(fā)酵細菌;化能類型自養(yǎng)微生物,如氧化硫或氧化鐵細菌;以及產(chǎn)甲烷類型的古細菌等[10-12].雖然黑頁巖與油頁巖有機質(zhì)均主要由復雜三維網(wǎng)狀結(jié)構的干酪根構成,但二者在有機物組成結(jié)構、生烴和排烴等方面仍有一定差別[13],至今對油頁巖本源微生物的全面調(diào)查研究尚缺乏報道.利用純培養(yǎng)方法可以直接獲得菌體細胞及菌落形態(tài)、營養(yǎng)及培養(yǎng)條件等指標,分離的單克隆菌株也可直接用來進行誘變等基因改造,在微生物功能特性的認識方面有獨特的優(yōu)勢,因此本研究選擇稀釋平板培養(yǎng)法對撫順盆地西露天組油頁巖本源微生物進行分離純化及分子鑒定,為后續(xù)從中分離功能菌株、改造功能基因提供清晰的生態(tài)背景信息.

1 材料與方法

1.1 材料

表1 含水量, 酸堿度, 總DNA含量和菌落總數(shù)(均值±標準差, n =3)Table1 Moisture content, pH, total DNA content and colony lump-sum(values were means ± S.D., n =3)

油頁巖于2011年6月采自撫順西露天礦(123°57′E,41°50′N,海拔75.9m).含礦區(qū)為溫帶大陸性季風氣候,年平均氣溫5～7℃,年降水量750～850mm.撫順盆地為半咸水淺湖拗陷沉積形成,有機質(zhì)來源以水生生物為主、陸源供給少,基底為下白堊統(tǒng)砂礫巖,油頁巖賦存于古城子組、計軍屯組和西露天組.樣品采自西露天組,采樣深度約30m.西露天組由較厚的綠色泥巖夾泥灰?guī)r層組成,互層頻繁,顏色為雜色及綠色.取樣時鏟去表面頁巖以防空氣及頁巖表面微生物混入樣品,并且佩戴無菌手套,采樣用鐵錘、小鏟子、篩子、報紙及離心管等工具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌后烘干.按五點法采集褐色油頁巖細粒,避開聚集在局部的黑色頁巖,錘子就地粉碎并充分混勻后過4mm無菌篩,四分法取適量放于50mL無菌離心管,與冰袋一起裝入保溫盒帶回實驗室4℃保存.3個重復取樣地間隔約500m.樣品經(jīng)測定灰分80.95%,揮發(fā)份16.57%,燒失量19.05%,水不溶物97.46%,含油率11.47%;X射線衍射分析主要為高嶺石、菱鐵礦和石英;X射線熒光定量元素分析 SiO2為43.90%,CO2為28.41%,Al2O3為17.08%,Fe2O3為5.36%,K2O為1.26%.樣品含水量、酸堿度、總DNA含量和活菌數(shù)量列于表1.

1.2 細菌的純培養(yǎng)與分子鑒定

樣品于無菌PBS(pH7.3)中180r/min振蕩后涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,每稀釋度(10-1～10-4)各3次重復且每次5個平行.挑取形態(tài)有差異的各菌落純化5代以上,直至平板內(nèi)菌體經(jīng)鏡檢完全一致.采用北京百泰克(BioTeke)的細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取菌落DNA,并以27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′和1492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′擴增1500bp左右的16S rDNA[14].PCR體系50μL:Mix(BioTeke)25μL,上下游引物(10μmol/L)各2μL,DNA40～50ng,滅菌高純水補足:PCR程序:94℃5min,并以94℃1min,55℃1min,72℃1min循環(huán)30次,72℃10min.培養(yǎng)基均購自杭州天和微生物試劑有限公司.引物合成和PCR產(chǎn)物測序均由上海生工生物工程有限公司完成.目的序列與數(shù)據(jù)庫 Genbank和 EzTaxon比對,用Clustal X 和 MEGA4軟件以鄰位連接(Neighbour-Joining)算法和 Kimura2-parameter模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3 真菌的純培養(yǎng)與分子鑒定

樣品加入PBS(pH5.9)后100r/min振蕩;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)28℃培養(yǎng)96h;采用上海生工生物工程有限公司的Ezup柱式真菌基因組 DNA抽提試劑盒提取菌落 DNA,并以ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴增550bp左右的rDNA ITS區(qū).PCR程序:94℃5min,并以94℃30s,55℃30s,72℃45s循環(huán)35次,72℃10min,4℃保存.其他同1.2節(jié).

1.4 分離菌株在油頁巖固體培養(yǎng)基上的生長

為了考察分離菌株在以油頁巖作為唯一碳氮源營養(yǎng)條件下的生長情況,將其培養(yǎng)于以油頁巖為底物、僅輔以少量無機鹽的油頁巖固體培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基成分:25g/L油頁巖(粒徑0.075～0.5mm),0.1g/L MgSO4·7H2O,0.01g/L MnSO4·4H2O,0.01g/L FeSO4·7H2O,瓊脂粉16g/L,pH7.3(細菌)或5.9(真菌).分離菌株劃線接種至上述油頁巖培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)5代.

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的純培養(yǎng)與分子鑒定

雖然分子生物學方法使微生物多樣性研究得到了極大的拓展,但是要了解微生物在生物圈行使的生態(tài)功能,對它們進行分離純化仍是一個必要手段.由平板分離法共獲得8株細菌單克隆,編號為菌株ZK2、ZK3、ZK4、ZK5、ZK8、ZK10、ZK12和ZK14(圖1),ZK4菌落較大,培養(yǎng)初期為淡粉色、后顏色逐漸加深轉(zhuǎn)為黃色;其他菌落直徑約1～3mm,ZK3、ZK5和ZK10為乳白色,其余為黃色或淡黃色,且ZK12和ZK14菌落中央顏色較深;ZK5、ZK10和ZK14菌落較干燥、粗糙、無光澤;ZK10與ZK2表面有凹突;ZK3菌落較透明.圖2(a)顯示各菌基因組長度約23kb;圖2(b)顯示各菌 PCR條帶明亮單一,與目的基因長度吻合.

圖1 細菌分離菌株的菌落形態(tài)和革蘭氏染色Fig.1 Colonial morphologies and Gram staining of bacterial isolates

圖2 瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoreses

分離菌株與數(shù)據(jù)庫中近似菌株的序列相似度均在99%以上,通常認為97%以上即為同屬同種微生物:ZK2為Lysinibacillus sp.,ZK3為Brevibacillus sp.,ZK5、ZK8、ZK10和ZK14為Bacillus spp.,ZK12為Paenibacillus sp.,ZK4為Rhodococcus sp.;將菌株ZK2、ZK3、ZK4、ZK5、ZK8、ZK10、ZK12和ZK14的16S rDNA序列提交至Genbank(NCBI),它們的登錄號為KJ191429～KJ191436,各菌株與模式菌株的遺傳進化關系如圖3.

圖3 根據(jù)16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree based on16S rDNA

同一分支代表親緣關系較近,不同分支則同源性相對較低.分離菌株中除ZK4為放線菌門外,其余均屬于厚壁菌門芽孢桿菌目細菌.芽孢類細菌對油頁巖的生物轉(zhuǎn)化機理尚不清楚,但在許多油藏環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)其存在[15].油頁巖與石油和煤等在結(jié)構組成上具有一定的同源性,即它們的形成有著相同的原始動植物有機物質(zhì),油頁巖低溫干餾時有機質(zhì)熱分解轉(zhuǎn)化為頁巖油,包括液態(tài)碳和氫,以及少量含氧、氮和硫的化合物,它與天然石油的不同之處在于其不飽和烴及非烴化合物含量較高,而油頁巖與煤的主要區(qū)別在于油頁巖的灰分在40%以上.有研究指出芽孢桿菌屬可以通過自身代謝產(chǎn)生生物表面活性劑,幫助細胞粘附于烴類物質(zhì)表面進行解烴代謝,生物表面活性劑還能夠降低表面張力促進微生物吸收和代謝疏水烴性物質(zhì)[16-18],以利于微生物在水不溶性物質(zhì)中生存,并且這種生物表面活性劑在極端條件下仍能夠保持活性[19].也有研究在硅酸鹽礦石環(huán)境中篩選出較多有特定功能的芽孢桿菌屬細菌,例如 Bacillus eχlorgllen,Bacillus circulans和Bacillus mucilaginous等[20],它們在生長過程中產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物能夠使礦石中的硅酸鹽礦物微粒分散到浸出液中,同時能釋放出硅酸鹽組成成分中的磷、鉀和硅等元素,達到降解硅酸鹽的目的.而短芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬在海灣表層沉積物中曾被發(fā)現(xiàn).放線菌是抗生素等生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)者,在深海和石油環(huán)境也廣泛存在[21],被認為在有機質(zhì)分解和礦化過程中起著重要作用.Rhodococcus以及Nocardioides, Arthrobacter, Nocardia, Micrococcus等放線菌類[22-25]均具有降解芳香烴等石油烴的能力.

2.2 真菌的純培養(yǎng)與分子鑒定

本研究共獲得4株真菌單克隆,編號為菌株K1,K2,K3和K4(圖4),它們均有毛絨狀菌絲;K1菌落為灰綠色,形狀不規(guī)則,其他菌落近似圓形,白色,且K4菌落中央呈淡黃色;K3及K4菌落中央較濕潤,其他均較干燥,粗糙,無光澤;K4有十字花裂紋.各菌靶序列PCR產(chǎn)物如圖5,可以看出片段長度位于 DL2000DNA Marker的750bp與500bp之間,與目的基因長度吻合.

圖4 真菌分離菌株的菌落形態(tài)Fig.4 Colonial morphologies of fungal isolates

分離菌株與數(shù)據(jù)庫中近似菌株的序列相似度均在99%以上:K1～K4依次為 Cladosporium sp.,Aspergillus sp.,Absidia sp.和Eupenicillium sp.;將菌株 K1～K4的 rDNA ITS序列提交至Genbank(NCBI),它們的登錄號為 KJ191437 ～KJ191440,各分離菌株與模式菌株所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6.除了 K3為接合菌門外,其他菌株均屬于子囊菌門.接合菌的主要特征是產(chǎn)生厚壁休眠體(接合孢子),該門有許多菌屬可以轉(zhuǎn)化甾族化合物.子囊菌門共1950屬15000余種,大部分營養(yǎng)體菌絲中有隔膜.接合菌和子囊菌的許多菌屬具有降解纖維素的能力.2.3 分離菌株在油頁巖固體培養(yǎng)基上的生長

圖5 PCR擴增rDNA ITSFig.5 PCR amplied products of rDNA ITS

圖6 根據(jù)rDNA ITS構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree based on rDNA ITS

將上述分離菌株接種在僅以油頁巖作為唯一碳氮源的簡單無機鹽培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),篩選出可良好利用油頁巖成分的菌株.將分離的真菌菌株培養(yǎng)于油頁巖固體培養(yǎng)基上,首代即沒有菌株成活;而細菌的油頁巖固體培養(yǎng)基實驗表明,ZK4-J和ZK5-J長勢較旺(繼代培養(yǎng)5代后的菌株編號為原菌株后加"-J",下同),如圖7,每代均有清晰而密集的菌落生長,但與利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)相比,菌落明顯較小而稀疏;ZK10-J和ZK12-J長勢居中,每代均有肉眼可見的稀疏菌落;ZK3-J和 ZK14-J長勢較差,每代僅有沿劃線位置兩側(cè)生長的菌落;而ZK2-J和ZK8-J于繼代培養(yǎng)過程中逐漸衰亡,不能在該培養(yǎng)基上連續(xù)生長.

圖7 繼代培養(yǎng)的菌落形態(tài)Fig.7 Colonial morphologies of the isolates with continuous transfers cultured

3 結(jié)論

3.1 利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基從撫順西露天組油頁巖中共分離出8株可培養(yǎng)細菌,屬于 Lysinibacillus, Brevibacillus, Paenibacillus, Rhodococcus和Bacillus;利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基從該樣品中共分離出4株真菌,屬于Cladosporium, Aspergillus,Absidia和Eupenicillium.

3.2 分離菌株中的6株細菌能夠在以油頁巖為唯一碳氮源的固體培養(yǎng)基上生長5代以上,其中ZK4(Rhodococcus sp.)和ZK5(Bacillus sp.)長勢明顯好于其他各菌,具有基因改造的潛力,而ZK2(Lysinibacillus sp.)和 ZK8(Bacillus sp.)以及所有分離的真菌菌株均不能夠在該培養(yǎng)基上連續(xù)生長.

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Isolation and identification of cultivable microorganisms in oil shale from Fushun western open group, China.

JIANG Shao-yan1,2, WANG Wen-xing3, XUE Xiang-xin1,2*
(1.Institute of Metallurgical Resources and Environmental Engineering, Northeastern University, Shenyang110819, China；2.Liaoning Key Laboratory of Metallurgical Resources Recycling Science, Shenyang110819, China；3.College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang110819, China). China Environmental Science,2014,34(8)：2126～2132

To study the diversity of cultured microorganisms from oil shale samples in Fushun west open pit mine, cultured microorganisms were isolated and purified by dilution-plate method, and then were identified and phylogenetically analyzed by16S rDNA sequences (bacteria) and ITS-rDNA sequences (fungi). The results showed that the8 bacterial isolates from nutrient agar medium belonged to5 genera (Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Paenibacillus and Rhodococcus), and the4 fungal isolates from potato dextrose agar medium belonged to4 genera (Cladosporium, Aspergillus, Absidia and Eupenicillium).2 bacterial strains (ZK4 and ZK5) could grow well on the agar medium with oil shale as the sole carbon and nitrogen source for more than5 generations, and were further considered as potential strains for the biotransformation of oil shale.

t：oil shale；microbial diversity；16S rDNA；rDNA ITS；phylogenetic analysis

X172

：A

：1000-6923(2014)08-2126-07

蔣紹妍(1985-),女,遼寧沈陽人,博士研究生,主要從事油頁巖微生物多樣性及油頁巖微生物轉(zhuǎn)化研究.發(fā)表論文7篇.

《中國環(huán)境科學》獲評“RCCSE中國權威學術期刊(A+)”

2013-11-05

國家自然科學基金資助項目(51204055);中國博士后科學基金資助項目(20100481205);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(N130420002)

* 責任作者, 教授, xuexx@mail.neu.edu.cn

《中國環(huán)境科學》在武漢大學中國科學評價研究中心發(fā)布的第三屆中國學術期刊評價中被評為“RCCSE中國權威學術期刊(A+)”.中國學術期刊評價按照各期刊的各指標綜合得分排名,將排序期刊分為A+、A、A-、B+、B、C6個等級,評價的6448種中文學術期刊中有1939種學術期刊進入核心期刊區(qū),其中權威期刊(A+)327種,核心期刊(A)964種,擴展核心期刊(A-)648種.此次獲得“RCCSE中國權威學術期刊(A+)”稱號的環(huán)境類期刊有3種.