氣相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜穩(wěn)定同位素稀釋法測定被動吸煙兒童尿液中的可丁寧

王 蕓， 黃志強(qiáng)， 葉 英， 張 瑩， 肖水源

（1.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長沙410078；2.湖南省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長沙410004；3.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，廣東 廣州510000；4.新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000）

世界上約有40%的兒童被動吸煙；在因被動吸煙早死的60萬人中，兒童約占28%。兒童被動吸煙易引起呼吸道感染、中耳炎、支氣管炎、哮喘、咳嗽癥狀以及行為和認(rèn)知障礙［1］。進(jìn)入人體內(nèi)的尼古丁約80%經(jīng)細(xì)胞色素氧化酶CYP2A6代謝為可丁寧，而可丁寧在體內(nèi)的半衰期為18～22 h，較尼古丁延長了約20 h，且尼古丁是可丁寧的唯一來源，從而更能反映人體3～4天被動吸煙情況。由于可丁寧在人體體液、臟器以及頭發(fā)、趾甲等部位分布廣泛［2］，因而被公認(rèn)為被動吸煙最佳的生物標(biāo)志物［3，4］。

生物樣品中可丁寧的檢測方法主要有放射免疫法［5］、酶聯(lián)免疫法［6，7］、氣相色譜法［8，9］、氣相色譜－質(zhì)譜法［10，11］、液相色譜法［12］、液相色譜－質(zhì)譜法［13］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［14－17］和氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GC－MS／MS）［18］等。但 GC－MS／MS技術(shù)在對被動吸煙人群可丁寧的分析應(yīng)用報道較少，方法的定量限在1～0.5μg／L 之間，難以滿足兒童尿液中可丁寧的測定要求。本文采用三氯甲烷提取、凈化，GC－MS／MS檢測被動吸煙兒童尿液中的可丁寧，基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)同位素稀釋法定量，方法定量限達(dá)到0.1μg／L。本方法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定性好，可以用于被動吸煙兒童尿液中可丁寧的監(jiān)測和吸煙人群戒煙效果的評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMSTQ8030，日本島津公司）；高速臺式離心機(jī)（UNIVERSAL 320，德國 Hettich公司）；快速混勻器（AHYQ SK－1，常州澳華儀器有限公司）；可丁寧（cotinine，純度為98%，購于美國Sigma公司）；可丁寧－d3（cotinine－d3，純度為99%，加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；三氯甲烷（色譜純）；無水硫酸鈉（分析純，用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，冷卻后放入干燥器中備用）；實驗用水均為蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取10.00 mg可丁寧標(biāo)準(zhǔn)品置于5 mL小燒杯中，用三氯甲烷溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為100 mg／L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存在－20℃冰箱中備用。稱取10.00 mg可丁寧－d3標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為100 mg／L單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存在－20℃冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：用空白尿液基質(zhì)提取液和標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成0.1、0.5、1、5、10μg／L 的可丁寧及2μg／L 可丁寧－d3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

尿液于5℃冰箱中冷藏保存。分析時，先將尿液在室溫下放置10 min，取2.0 mL尿液于試管中，加入 20μg／L 可 丁寧－d3溶液 200μL，加入 1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿液pH為10，再加入1 mL飽和硫酸鈉溶液，最后加入2.0 mL三氯甲烷溶液，于渦旋混合器上充分混勻1 min，以 7 000 r／min速度離心10 min，下層有機(jī)相收集于自動進(jìn)樣瓶中，供GC－MS／MS測定。

1.4 分析條件

色譜柱：Rxi－5 Sil MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm（美國RESTEK公司）；載氣：高純氦氣（純度99.999%），柱內(nèi)流量1.48 mL／min；柱溫程序：初始溫度60℃（保持0.5 min），以40℃／min 升溫至200℃（保持0.5 min），再以10℃／min 升溫至220℃（保持0.5 min），最后以40℃／min 升溫至300℃（保持3 min）；進(jìn)樣口溫度：270℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時間1 min；總運行時間12 min。

離子源溫度：230℃；電離模式：電子轟擊電離（EI）；轟擊能量：70 eV；燈絲電流：150μA；碰撞氣：氬氣（純度99.999%）；碰撞電壓：可丁寧8 eV，可丁寧－d36 eV；溶劑延遲時間：4.5 min；數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）?？啥幎侩x子對為m／z 176.10＞98.05，定 性 離 子 對 為 m／z 176.10＞147.05和 m／z 147.05＞118.05；可丁寧－d3定量離子對為m／z 179.10＞101.10，定性離子對為 m／z 179.10＞147.05和m／z 101.10＞73.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

選取正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等3種溶劑，按前述樣品前處理步驟處理尿液，采用正己烷、乙酸乙酯提取尿液時，絮狀沉淀物多，乳化現(xiàn)象非常嚴(yán)重，分層困難，可丁寧加標(biāo)回收率非常低；而采用三氯甲烷提取時分層明顯，無乳化現(xiàn)象，加標(biāo)回收率穩(wěn)定，故選擇了三氯甲烷作為萃取溶劑。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

采用三氯甲烷溶液和空白尿液提取液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種溶液等體積進(jìn)樣，測量峰面積，比較兩組溶液響應(yīng)值的差異，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)配對t檢驗，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＝0.030），圖1表明基質(zhì)提取液對可丁寧響應(yīng)信號有明顯增強(qiáng)作用，尿液基質(zhì)效應(yīng)明顯。因此，本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

2.3 GC－MS／MS條件優(yōu)化

圖1 三氯甲烷和空白尿液基質(zhì)中的可丁寧在GC－MS／MS分析中的峰面積Fig.1 Peak areas of the cotinine in chloroform and blank urine matrix by GC－MS／MS analysis

圖2 （a）空白尿液提取液、（b）空白尿液基質(zhì)匹配可丁寧（10 μg／L）和內(nèi)標(biāo)可丁寧－d3（2μg／L）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 MRM的總離子流色譜圖和（c）可丁寧的離子對色譜圖Fig.2 MRM total ion chromatograms of（a）blank urine matrix，（b）blank urine matrix spiked with the cotinine（10μg／L）and internal standard cotinine－d3（2μg／L）mixed standard solution and （c）MRM chromatogram of transition of cotininePeak identifications：1.cotinine－d3；2.cotinine.

空白尿液提取液、空白尿液基質(zhì)匹配可丁寧和可丁寧－d3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖2a和2b；在2～40 eV范圍內(nèi)優(yōu)化碰撞電壓，最終選定m／z 176.10＞98.05作為可丁寧的定量離子對，m／z 176.10＞147.05和m／z 147.05＞118.05作為可丁寧的定性離子對 （見圖 2c）；m／z 179.10＞101.10作為可丁寧－d3的定量離子對，m／z 179.10＞147.05和m／z 101.10＞73.05作為可丁寧－d3的定性離子對，與其他質(zhì)譜檢測采用優(yōu)化方法一致［19］。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍和定量限

本文采用空白尿液基質(zhì)提取液（按1.3節(jié)制備）準(zhǔn)確配制含量分別為0.1、0.5、1、5和10μg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4節(jié)條件進(jìn)行測定，以可丁寧濃度／可丁寧－d3濃度比值與可丁寧峰面積／可丁寧－d3峰面積比值繪制曲線圖，可丁寧在空白尿液基質(zhì)中的線性關(guān)系良好，其線性范圍為0.1～10 μg／L，在相應(yīng)的含量范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)（r）大于0.998。在信噪比（S／N）大于10時，通過回收率試驗確定兒童尿液中可丁寧的定量限為0.1μg／L，能夠滿足被動吸煙兒童尿液中可丁寧的測定。

2.4.2 回收率

在空白兒童尿液中分別添加0.1、1和10μg／L的可丁寧進(jìn)行回收率試驗；對含有可丁寧的兒童尿液分別添加大約0.5倍、2倍和4倍本底值濃度的可丁寧進(jìn)行回收率試驗。測定結(jié)果見表1。

表1 尿液樣品中可丁寧的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 1 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of cotinine spiked in urine samples（n＝6）

表1數(shù)據(jù)表明：可丁寧在尿液中的回收率為79.2%～112.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6%以內(nèi)。與其他研究［6，20，21］相比有較好的準(zhǔn)確度和精密度；方法準(zhǔn)確度、精密度能滿足被動吸煙兒童生物標(biāo)志物可丁寧的檢測要求。

2.4.3 日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確性

在空白尿液中分別加入0.1、1和10μg／L 可丁寧及2μg／L可丁寧－d3混合溶液，分別平行處理6個樣品，按前述方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 尿液中可丁寧測定的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確性Table 2 Intra－day and inter－day precisions and accuraciesof analysis for cotinine in urine samples

2.4.4 穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)工作液的穩(wěn)定性：以三氯甲烷溶液配制3個不同濃度（0.3、1和10μg／L）的可丁寧及2μg／L可丁寧－d3標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別在當(dāng)天和室溫下在自動進(jìn)樣器上放置24 h后檢測，重復(fù)測量6次。兩次測得的結(jié)果相對偏差均小于1%。同時對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，兩組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)意義（p≥0.05）。說明標(biāo)準(zhǔn)工作液在常溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

處理后的尿樣穩(wěn)定性：室溫下將尿樣提取液放置在自動進(jìn)樣器上至少24 h。24 h后對10個尿樣提取液進(jìn)行檢測，相對偏差小于1%，說明常溫下尿樣提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

短期穩(wěn)定性：尿樣在5℃和－10℃下儲存，分別在第0、1、2、3和5天進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)2次。在5℃條件下，測得結(jié)果的相對偏差小于4%；－10℃條件下，測得結(jié)果的相對偏差小于3%。說明尿樣可以在5℃和－10℃條件下穩(wěn)定儲存5天。

長期穩(wěn)定性：將尿樣儲存在－20℃的冰箱內(nèi)，在第0、3、5、13、15、20、28天分別進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)測量2次。測得結(jié)果的相對偏差小于2%。實驗結(jié)果表明：在－20℃條件下儲存尿樣28天，尿樣是穩(wěn)定的。

融凍循環(huán)的穩(wěn)定性：樣品儲存在－20℃冰箱內(nèi)24 h后，取出在室溫下自行融化。當(dāng)尿樣完全融化后，再次放入相同條件下冷凍24 h。這個融凍循環(huán)重復(fù)2次后樣品被再次分析，至少在3次融凍循環(huán)下，相對偏差小于10%說明樣品是穩(wěn)定的。我們對5個兒童尿樣進(jìn)行了分析，結(jié)果相對偏差均超過10%，提示尿樣在反復(fù)融凍循環(huán)下，穩(wěn)定性較差。

2.5 實際樣品測定

為驗證方法的有效性，對幼兒園60名5～6歲被動吸煙兒童尿液進(jìn)行了檢測。60名被動吸煙兒童中有10名兒童尿液未檢測出可丁寧，即尿液中的可丁寧＜0.1μg／L，50名被動吸煙兒童尿液檢測出可丁寧質(zhì)量濃度范圍在0.42～27.76μg／L。

3 結(jié)論

采用三氯甲烷萃取、凈化，建立了GC－MS／MS同位素稀釋法測定被動吸煙兒童尿液中可丁寧的方法，方法的線性、準(zhǔn)確度、精密度滿足方法學(xué)要求，方法定量限達(dá)到0.1μg／L，可以對兒童尿液中痕量可丁寧進(jìn)行定量檢測和確證。方法準(zhǔn)確、可靠、快速、靈敏，可作為兒童被動吸煙的監(jiān)測、個體吸煙和被動吸煙者自報準(zhǔn)確性的驗證，也可作為評價戒煙和被動吸煙干預(yù)的有效手段。

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