非消化性寡糖對兩株益生菌體外增殖的影響

杜昭平，馬成杰，華寶珍，徐愛才，徐志平，馬愛民

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

非消化性寡糖（Nondigestible oligosaccharides，NDOs）是一類不能在哺乳動物上消化道被分解或吸收的寡糖類碳水化合物[1]，大部分非消化性寡糖進(jìn)入消化道后段后可以選擇性地刺激大腸中的一種或幾種有益細(xì)菌的代謝和繁殖，從而對宿主健康產(chǎn)生有益功效，因此也被稱為益生元（Prebiotics）[2]。研究表明，低聚果糖[3]、低聚半乳糖[4]、菊粉[5]以及棉籽糖、水蘇糖[6]都可作為雙歧因子（Bifidus factor）促進(jìn)哺乳動物腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長，抑制致病菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善腸道菌群微環(huán)境[7]，因此多數(shù)非消化性寡糖被作為功能性食品配料，用于各類保健益生功能食品的研究與開發(fā)[8-9]。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC2W（CGMCC No.0828）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III（CGMCC No.0847）在模擬人體消化環(huán)境中具有較強(qiáng)的耐受性和優(yōu)異的存活性能[10]，降高血壓、降低膽固醇、控制體重[11]等益生功能明顯，具備良好的應(yīng)用開發(fā)潛力，但L.casei LC2W在牛乳中生長比較緩慢，L.plantarum ST-III在牛乳中產(chǎn)酸能力很弱，不能凝乳[12]，這些因素成為限制L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在發(fā)酵乳制品工業(yè)中的規(guī)?；瘧?yīng)用的瓶頸。本研究通過驗證不同的非消化性寡糖對L.casei LC2W和L.plantarum ST-III的體外增殖促進(jìn)效應(yīng)，為這兩株益生菌在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用和合生元產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉（蛋白質(zhì)含量33.4%）：新西蘭恒天然公司；非消化性寡糖及其來源低聚果糖（Fructo-Oligosaccharide，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（Galacto-Oligosaccharide，GOS）、菊粉（Inulin）：江門量子高科生物工程有限公司；低聚木糖（Xylo-oligosaccharide，XOS）：山東龍力生物科技有限公司；低聚異麥芽糖（Isomal tooligosaccharide，IMO）：保齡寶生物股份有限公司；棉子糖（Raffinose）：北京中棉紫光生物科技有限公司；水蘇糖（Stachyose）：西安菲德生物科技有限公司。酪蛋白胨、牛肉膏、酵母抽提物：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；所有試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種：L.casei LC2W、L.plantarum ST-III（冷凍干燥菌粉）：光明乳業(yè)股份有限公司。

MRS 培養(yǎng)基[13]：酪蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 8.0 g，酵母抽提物4.0 g，葡萄糖20.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，NaAc 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，Tween801mL，溶于蒸餾水中并定容至1000mL，121℃高壓滅菌15 min。

MRS-NDOs培養(yǎng)基：分別將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖等量替換為表1所示的各種非消化性寡糖，其余配方同MRS培養(yǎng)基。

Glucose-free MRS培養(yǎng)基：將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖除去，其余配方同MRS培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

Bactron-I培養(yǎng)箱：美國Shellab公司；SA-300VF高壓蒸汽滅菌器：德國Sturdy Industrial公司；UV-1800分光光度計：日本Shimadzu公司；GFL1002恒溫水浴鍋：德國GFL公司；868型pH計：美國Thermo Orion公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化與菌懸液制備

將適量L.casei LC2W和L.plantarum ST-III冷凍干燥菌粉分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接活化2次～3次后，經(jīng)4 000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀，經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌2次后制成菌懸液，于4℃下保存?zhèn)溆肹14]。

1.4.2 益生菌在MRS-NDOs液體培養(yǎng)基中的生長曲線

以1%的接種量，分別接種L.casei LC2W和L.plantarum ST-III菌懸液于 MRS、MRS-NDOs和 Glucose-free MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)過程中，以未接種的液體培養(yǎng)基為參照，每小時測定一次樣品在600 nm波長下的吸光值OD600。

1.4.3 NDOs對益生菌發(fā)酵脫脂牛乳的影響

1.4.3.1 不同NDOs對益生菌在脫脂乳中繁殖產(chǎn)酸的影響

分別向濃度為12%的脫脂牛乳中添加表1所示的8種非消化性寡糖，使其終濃度為1%。充分?jǐn)嚢枞芙夂螅?5℃水浴殺菌30 min，待冷卻至37℃時，以3.0×106CFU/mL的接種量，接種L.caseiLC2W或L.plantarum ST-III菌懸液，混勻后于37℃靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵乳中益生菌菌落總數(shù)、乳酸含量及pH。

1.4.3.2 NDOs添加量對益生菌在脫脂乳中增殖的影響

選取對益生菌發(fā)酵脫脂乳具有明顯促進(jìn)作用（P＜0.01）的非消化性寡糖，分別以 0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%和5%的添加量加入脫脂牛乳中，經(jīng)殺菌、冷卻、接種，于37℃靜置發(fā)酵24 h后，測定發(fā)酵乳中益生菌菌落總數(shù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)檢測與分析

參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.35-2010《乳酸菌檢驗》的方法測定發(fā)酵乳樣品的L.casei LC2W和L.plantarum ST-III菌落總數(shù)，參照GB/T 5413.34-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測定》的方法測定發(fā)酵乳樣品的乳酸含量，使用Orion868 pH計測定發(fā)酵乳的pH；利用SPSS 13.0 for Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株益生菌在MRS-NDOs液體培養(yǎng)基中的生長曲線

L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在不同碳源的MRS液體培養(yǎng)基中的吸光值如圖1和圖2所示。

L.casei LC2W在MRS-GOS和MRS-Inulin中的生長曲線與在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線基本一致，意味著L.casei LC2W能夠有效利用GOS和Inulin作為碳源進(jìn)行增殖；L.casei LC2W對IMO和FOS的利用效率次之，而幾乎無法以Raffinose、XOS和Stachyose為唯一碳源進(jìn)行生長繁殖，培養(yǎng)期間吸光值的微弱上升可能是由于非消化性寡糖中殘存的部分可利用的碳源維持了L.casei LC2W的緩慢增殖[15]。

圖1 L.casei LC2W在不同碳源的MRS培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of L.casei LC2W in MRS medium with different carbon sources

圖2 L.plantarum ST-III在不同碳源的MRS培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of L.platarum ST-III in MRS medium with different carbon sources

L.plantarum ST-III對Inulin和Raffinose的利用效率最高，其生長曲線與在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線基本一致；但對IMO的利用效率最低，其生長曲線與在Glucose-free MRS培養(yǎng)基中的生長曲線基本相同；以 XOS、Stachyose、FOS 和 GOS 為唯一碳源時，L.plantarum ST-III生長較緩慢，說明L.plantarum ST-III對上述碳源的利用效率不高。

2.2 NDOs對兩株益生菌在脫脂乳中繁殖產(chǎn)酸的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的非消化性寡糖對L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在脫脂乳中的增殖具有不同的影響。如表1所示，添加GOS和Inulin后，與對照組相比，L.casei LC2W發(fā)酵乳的pH值和乳酸含量差異顯著（P＜0.05），L.casei LC2W菌數(shù)對數(shù)值差異極顯著（P＜0.01），其余非消化性寡糖對L.casei LC2W的增殖作用不明顯（P＞0.05）。

如表2所示，GOS和XOS均對L.plantarum ST-III在脫脂乳中的增殖具有促進(jìn)作用，菌數(shù)對數(shù)值、發(fā)酵乳pH和乳酸含量有顯著差異（P＜0.05）；而FOS的添加僅使發(fā)酵乳pH和乳酸含量有顯著差異（P＜0.05），L.plantarum ST-III菌數(shù)對數(shù)值無明顯差異（P＞0.05）；Raffinose和Inulin對L.plantarum ST-III在脫脂乳中的增殖促進(jìn)作用最為明顯，菌數(shù)對數(shù)值、發(fā)酵乳乳酸含量及pH均與對照組差異極顯著（P＜0.01）。

表1 NDOs對L.casei LC2W在脫脂乳中增殖的影響Table 1 Influence of NDOs on the proliferation of L.casei LC2W in skim milk

表2 NDOs對L.plantarum ST-III在脫脂乳中增殖的影響Table 2 Influence of NDOs on the proliferation of L.plantarum ST-III in skim milk

2.3 NDOs添加量對益生菌在脫脂乳中繁殖產(chǎn)酸的影響

選取對L.casei LC2W發(fā)酵脫脂乳具有明顯促進(jìn)作用（P＜0.01）的GOS和Inulin，以及對L.plantarum ST-III發(fā)酵脫脂乳具有明顯促進(jìn)作用（P＜0.01）的Raffinose和Inulin，分別以不同的濃度添加到脫脂乳中，其對兩株益生菌的增殖促進(jìn)效果如圖3和圖4所示。

圖3 NDOs添加量對發(fā)酵乳中L.casei LC2W菌數(shù)的影響Fig.3 Influence of NDOs addition on the colony account of L.casei LC2W in fermented milk

圖4 NDOs添加量對發(fā)酵乳中L.plantarum ST-III菌數(shù)的影響Fig.4 Influence of NDOs addition on the colony account of L.plantarum ST-III in fermented milk

當(dāng)添加量在0.2%～3%的區(qū)間范圍內(nèi)時，發(fā)酵乳中L.casei LC2W菌數(shù)隨著GOS和Inulin的添加量的增加而迅速上升；添加量超過3%后，菌數(shù)反而呈下降趨勢，這可能是由于高濃度的非消化性寡糖在培養(yǎng)基中形成了較高的滲透壓，因而對益生菌的生長繁殖產(chǎn)生了抑制作用[16]。因此，GOS或Inulin添加量為3%時，對L.casei LC2W在脫脂乳中的生長促進(jìn)效應(yīng)最佳。

隨著Raffinose和Inulin添加量的增加，發(fā)酵乳中L.plantarum ST-III菌數(shù)一直呈上升趨勢。當(dāng)Raffinose和Inulin添加量低于2%時，ST-III菌數(shù)隨添加量增加而迅速升高；隨著添加量的繼續(xù)增加，L.plantarum STIII菌數(shù)上升幅度明顯減緩，而高濃度的Raffinose和Inulin并未對L.plantarum ST-III的生長繁殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，這可能是由于ST-III菌株的抗?jié)B透壓能力較強(qiáng)?？紤]到添加成本，Raffinose和Inulin的最佳添加量為2%。

舒國偉等[17]的研究表明，Stachyose和GOS可以促進(jìn)兩歧雙歧桿菌BB01的體外增殖，XOS對BB01菌株的生長沒有影響，而李艷麗等則報道XOS對乳酸桿菌的增殖效果非常明顯，XOS添加量為0.2%時對乳酸桿菌的增殖作用達(dá)311%，添加量進(jìn)一步增加時反而會抑制乳酸桿菌的生長[18]。由此可見，不同益生菌菌株對非消化性寡糖發(fā)揮體外增殖效應(yīng)具有一定的選擇性。這種選擇性可能是由菌株的生理生化特性決定的[19]。

3 結(jié)論

GOS和Inulin對L.casei LC2W在MRS-NDOs液體培養(yǎng)基和脫脂乳中的增殖具有極顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01）；GOS和XOS可以顯著促進(jìn)L.plantarum STIII在脫脂乳中的增殖（P＜0.05），而對 L.plantarum STIII增殖促進(jìn)作用最顯著的是Raffinose和Inulin（P＜0.01），其余非消化性寡糖對這兩株益生菌的體外增殖促進(jìn)效應(yīng)較弱，甚至不能發(fā)揮促進(jìn)作用。

非消化性寡糖促進(jìn)L.casei LC2W和L.plantarum ST-III體外增殖的最佳添加濃度不同，GOS和Inulin促進(jìn)L.casei LC2W的最佳濃度為3%，且高濃度會產(chǎn)生抑制效應(yīng)；Raffinose和Inulin促進(jìn)L.plantarum STIII的最佳濃度為2%。

[1] Roberfroid M,Slavin J.Nondigestible oligosaccharides[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2000,40(6):461-480

[2] Chauhan S V,Chorawala M R.Probiotics,prebiotics and synbiotics[J].International Journal of Pharmaceutical Science and Research,2012,3(3):711-726

[3] 杭鋒,伍劍鋒,王蔭榆,等.低聚果糖調(diào)節(jié)人體腸道菌群功能的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2010,3(6):108-111

[4]BEN X M,ZHOU X Y,ZHAO W H,et al.Supplementation of milk fomula with galacto-oligosaccharides improves intestinal micro-flora and fermentation in term infants[J].Chinese Medical Journal(English),2004,117(6):927-931

[5] Metzler B U,Mosenthin R.A review of interactions between dietary fiber and the gastrointestinal microbiota and their consequences on intestinal phosphorus metabolism in growing pigs[J].Asian-Australasian Journal of Animal Science,2008,21(4):603-615

[6]楊東升.益生菌雙歧桿菌作用機(jī)制的研究[J].食品研究與開發(fā),2004,25(4):61-65

[7] Bouhnik Y,Raskine L,Simoneau G,et al.The capacity of nondigestible carbohydrates to stimulate fecal bifidobacteria in healthy humans:a double-blind,randomized,placebo-controlled,parallelgroup,dose-responserelation study[J].TheAmerican Journal of Clinical Nutrition,2004,80(6):1658-1664

[8] 劉冬,葉明,葉玉娥,等.富硒酸奶發(fā)酵劑的制備及其發(fā)酵性能研究[J].食品科學(xué),2011,32(6):76-79

[9] 姜瞻梅,鄭文靜,黃占權(quán),等.防便秘酸乳的研制[J].中國乳品工業(yè),2010,38(2):28-29

[10]辛羚,郭本恒,吳正鈞.3株乳桿菌在模擬消化環(huán)境中存活性能的研究[J].中國乳品工業(yè),2005,33(5):15-17

[11]吳正鈞.干酪乳桿菌LC2W菌體的抗高血壓作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011,23(2):228-231

[12]陳帥.促進(jìn)植物乳桿菌ST-III在脫脂乳中生長營養(yǎng)因子的研究[D].無錫:江南大學(xué),2009

[13]唐瑩瑩,羅愛平,尹彥洋,等.益生元及促生因子促使鼠李糖乳桿菌對牛骨鈣的轉(zhuǎn)化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2001,37(8):95-99

[14]李程程,陳曉紅,姜梅,等.一株產(chǎn)黏植物乳桿菌發(fā)酵豆乳條件優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(17):201-205

[15]Rycroft C E,Jones M R,Gibson G R,et al.A comparative in vitro evaluation of the fermentation properties of prebiotic oligosaccharides[J].Journal of Applied Microbiology,2001,91(5):878-887

[16]肖仔君,陳惠音,楊汝德.復(fù)合低聚糖對短雙歧桿菌增殖作用的初步研究[J].食品工業(yè)科技,2005,26(7):102-106

[17]舒國偉,季麗媛,陳合,等.水蘇糖、低聚木糖及半乳糖對雙歧桿菌生長的影響[J].食品科技,2011,36(6):6-8

[18]李艷麗,許少春,柳永,等.低聚木糖的制備及其對益生菌體外增殖的作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2011,37(3):245-251

[19]周慶民,馮萬,李桂偉,等.復(fù)合低聚糖對奶牛主要腸道菌體外生長的影響[J].中國乳業(yè),2011,115(2):34-35