阿魏菇多糖的分離純化與結構分析

劉冰，許程劍，*，王月香，孫然，牛博楠，盧士玲，李應彪

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.石河子大學第一附屬醫(yī)院老干一科，新疆石河子832000）

阿魏菇又名阿魏側耳、阿魏蘑，因其生長在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子實體具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。據(jù)報道[1-2]阿魏菇屬高蛋白、低脂肪、高碳水化合物、高纖維素營養(yǎng)食品。其中多糖含量在10%以上，阿魏菇中所含的多糖是重要的生物活性成分，具有增強人體免疫力，減少輻射危害、抗腫瘤調節(jié)人體生理平衡等作用。多糖的生物活性決定于其自身結構，了解多糖的基本組成和簡單結構是研究多糖藥理活性的理論基礎。近幾年，有關阿魏菇多糖的研究較少，原子力顯微鏡（AFM）觀察阿魏菇多糖分子的微觀結構也未見報道[3-5]。本實驗對阿魏菇多糖進行提取、分離純化，通過薄層色譜分析單糖組成，并利用紅外光譜和原子力顯微鏡對純化分級的多糖結構進行了研究，這為系統(tǒng)的研究阿魏菇多糖的組分、結構及進一步弄清其構效活性關系提供了理論參考，在功能性食品的開發(fā)和阿魏菇的深加工等方面具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏菇（新疆清河）；DEAE-Cellulose和Sephadex G-100（Pharmacia公司）；濃硫酸、苯酚、苯胺、鄰苯胺、無水乙醇、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、正丁醇、過硫酸銨、阿里新蘭染色液、氯化鈉、氫氧化鈉、溴化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

FDU-1200真空冷凍干燥機：上海精宏試驗設備有限公司；Ultrospec-5300紫外分光光度儀：日本島津公司；ZXRD-7080鼓風干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；D36mm透析袋（XH419）：北京鼎國生物技術有限責任公司；ENK-PRO酶標儀：美國Bio-teck生產(chǎn)；HX-DBS-100電腦全自動部分收集器：京恒奧德儀器儀表有限公司；ZD11-WD121紅外分析儀器：北京中西化玻儀器公司；KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HL-1恒流泵：蘇州江東精密儀器有限公司；Nano-R2原子力顯微鏡：上海實密國際貿易有限公司；GRX-9073A熱空氣消毒箱：上海一恒科技有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機：力康發(fā)展有限公司；DYY—Ⅲ6B電泳儀：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿魏菇粗多糖制備

挑選新鮮阿魏菇，剪碎并打漿后，在超聲輔助下[6]熱水浸提5 h，4層紗布過濾，然后離心除去雜質，收集濾液，濃縮到適當體積。經(jīng)Savage法除蛋白[7]，然后加入4倍體積、濃度為100%的乙醇，在4℃下醇沉時間12 h。所得沉淀用75%乙醇洗滌2次，然后用60℃蒸餾水溶解，離心去除雜質，取上清液繼續(xù)醇沉，所得絮狀沉淀物質即為阿魏菇粗多糖。繼續(xù)加水溶解，透析2 d后冷凍干燥得阿魏菇總多糖。

1.2.2 阿魏菇多糖的分離與純化

1.2.2.1 多糖的凝膠層析

將冷凍干燥得到的多糖20 mg溶解到5 mL蒸餾水里，6 000 r/min離心10 min，取上清液過凝膠柱DEAE-Cellulose，用不同濃度的NaCl洗脫[8]，并用全自動數(shù)據(jù)收集器收集洗脫液。然后用苯酚-硫酸法[9]測定每管多糖含量。將獲得的組分真空冷凍干燥后，再通過Sephadex G-100時用蒸餾水洗脫，并收集洗脫液，同樣方法測多糖含量。

1.2.2.2 多糖小分子的脫除

粗多糖中含有各種分子量大小的雜質，包括一些小分子物質，而多糖自身的分子量較大。透析膜可以通過膜內外溶液的濃度差實現(xiàn)物質交換，依濃度梯度從濃度高的一側向濃度低的一側移動，而水分子則按滲透梯度從滲透濃度低的一側流向滲透濃度高的一側，因此多糖去蛋白液中的小分子物質能通過膜遷移到溶液中去，大分子物質則留在膜內，從而將阿魏菇多糖小分子脫除。

1.2.2.3 多糖得率計算

式中：C為根據(jù)吸光度計算出的葡萄糖濃度，（mg/mL）；V為不同的液料比比值；N為旋轉蒸發(fā)后稀釋的倍數(shù)；M為阿魏菇樣品的重量，g。

1.2.2.4 單因素試驗

根據(jù)已有研究[6]，選擇影響多糖得率的幾個因素：超聲時間、超聲溫度、超聲功率、液料比進行單因素實驗，分別考察各因素對阿魏菇多糖得率的影響。并以此為試驗因子，進行正交設計。

1.2.3 阿魏菇多糖的分析鑒定

1.2.3.1 多糖的薄層色譜分析

多糖的水解[10]：取純化后樣品10 mg于安瓿瓶中，加入2 mol/L的H2SO45mL，密封，振蕩至樣品完全水解，然后置于110℃烘箱中反應12 h，反應完成后冷卻至室溫，加BaCO3中和，在3 000 r/min的離心機中離心取上清液備用。采用薄層色譜法標準操作規(guī)程，薄層板以含3%CMC和3%的硅膠G鋪板，展開劑為正丁醇：丙酮：水（4∶3∶1），將水解后的多糖與標準單糖在薄層板上每隔1.5 cm用毛細管點樣，吹干后室溫下置層析缸內自下向上展開，當展開劑到達離薄層板頂端約1 cm處取出薄層板，前沿做記號，60℃烘干2 h～3 h（或者薄層板在空氣中晾干）后噴灑苯胺-鄰苯胺顯色劑，于110℃烘箱中加熱10 min，根據(jù)不同單糖的顯色顏色不同和展開距離不一樣來判斷多糖中單糖的組分。

1.2.3.2 多糖的紫外光譜分析

將多糖配置成濃度為500 mg/mL的水溶液，用紫外光譜儀測定波長200 nm～400 nm的紫外光譜。

1.2.3.3 多糖的紅外光譜分析

將干燥的分離純化阿魏菇多糖組分1mg于潔凈的瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨成細粉，再加入約100mg干燥的KBr一起研磨至二者完全混合均勻，顆粒粒度約為2 μm以下。取適量的混合樣品于潔凈的壓片模具中，制成透明試樣薄片，要求壓片不可太厚。以不加多糖樣品的KBr為空白，同樣方法制樣片。將試樣薄片裝在磁性樣品架上，放入紅外光譜儀的樣品室中，在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間進行紅外光譜掃描，先測空白背景，再將樣品置于光路中，測定樣品紅外光譜，進行修正，觀察譜峰情況。

1.2.3.4 多糖原子力顯微鏡（AFM）觀測

準確稱取1mg分離純化的組分。配制成20 μg/mL多糖溶液，冷卻至室溫，再稀釋至2 μg/mL。用移液槍吸取3 μL多糖溶液，滴在新鮮解離的云母片上，空氣中干燥大約20 min，待樣品干燥后即可進行原子力顯微鏡（AFM）觀測。

1.2.3.5 多糖凝膠電泳測定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠法：將阿魏菇多糖C溶解于蒸餾水中，配成5 mg/mL的多糖溶液，備用。配制5%分離膠和3%的濃縮膠并處理樣品溶液，衡壓40 v進行電泳，再以阿里新蘭染色。

2 實驗結果與分析

2.1 透析

根據(jù)預實驗結果，選用截留分子量為8×103～1.2×104的透析袋進行透析，可以達到理想的效果。

2.2 單因素試驗結果

根據(jù)進一步實驗研究表明超聲時間70 min、超聲功率160 W、超聲溫度60℃、液料比為30∶1為最佳工藝，阿魏菇多糖的平均得率為11.08%[6]。

2.3 多糖組分純化

圖1為阿魏菇總多糖通過DEAE-Cellulose后，苯酚-硫酸法測定每管多糖的含量而得。

圖1 阿魏菇多糖DEAE-Cellulose洗脫圖Fig.1 Mushrooms polysaccharide on DEAE-52 elution diagram

由圖1可以看出，洗脫曲線有兩個峰，表明阿魏菇總多糖經(jīng)過DEAE-52分離純化出兩種組分，分別命名為A、B。對圖1所得的A、B組分進行收集合并冷凍干燥，所得樣品進行Sephadex G-100的凝膠層析柱，得到兩個洗脫峰，見圖2。

圖2 阿魏菇多糖Sephadex G-100洗脫圖Fig.2 Mushrooms polysaccharide Sephadex G-100 elution diagram

同樣收集合并經(jīng)冷凍干燥得純品阿魏菇多糖命名C。多糖是大分子化合物，即使是純品，其微觀也是不均一的。它的純度只代表某一多糖的相似鏈長的平均配布。同時，根據(jù)聚電解質效應，考慮到多糖組分在水中可能有弱的電離，濃度越低電離度越大，大分子所帶電荷越多，促使原來蜷曲的大分子鍵伸展開來；另外，溶液越稀，水分子越易向大分子內部擴散，使其體積膨脹。大分子團的膨脹和分子鍵的伸展造成了洗脫體積的增大。這也說明了采用不同方法檢驗多糖純度是必要的。

2.4 薄層色譜分析結果

薄層色譜分析結果見圖3。

圖3 阿魏菇多糖薄層色譜分析圖Fig.3 TLC analysis of mushrooms polysaccharide

圖中1至6點樣分別是葡萄糖、果糖、樣品、半乳糖、木糖、甘露糖。通過薄層色譜分析，對比于各單糖的展開效果及顯色效果，結果表明總多糖可能是由半乳糖，葡萄糖，果糖，甘露糖組成。有研究表明[11]，一些多糖的抗腫瘤活性強弱與其甘露糖含量呈現(xiàn)正相關，但是對于降血糖活性是否存在這樣的關系有待進一步考證。本實驗通過綜合對比幾種分析多糖的單糖組成成分的方法，最后采用TLC法，其操作簡單，快速，但由于多糖水解成單糖后其極性相近，因此有可能會達不到理想效果，有待進一步研究。

2.5 多糖的紫外掃描結果

多糖的紫外掃描結果見圖4。

圖4 阿魏菇多糖紫外光譜圖Fig.4 The UV spectrum of mushrooms polysaccharide

由圖4可知，阿魏菇的多糖紫外光譜為典型的多糖光譜，在260、280 nm處無吸收峰，表明無核酸、蛋白質等雜質。

2.6 多糖紅外分析結果

多糖紅外分析結果見圖5。

圖5 阿魏菇多糖紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of mushrooms polysaccharide

阿魏菇多糖C組分用KBr壓片法，在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間內攝得紅外光譜，主要吸收峰有3 417.8、2 926.7、1 738.6、1 643.6、1 152.5、1 025.7 cm-1，通過紅外圖譜可以看出，在3 417.85 cm-1處有強峰值，表明有多糖分子間或分子內的氫鍵，是O-H的伸縮振動峰，由于羥基形成氫鍵，吸收峰變寬，2 926.7 cm-1處有一中強強吸收峰，為糖鏈中次甲基（-CH2-）C-H伸縮振動引起，在這個區(qū)域的兩組吸收峰是糖類的特征峰；在 1 738.6 cm-1和1 643.6、1 026.7 cm-1和1 152 cm-1的吸收峰是吡喃糖環(huán)的兩種C-O伸縮震動引起的，其中一種屬于C-O-H，另一種屬于糖環(huán)的CO-C。

2.7 多糖原子力分析結果

多糖原子力分析結果見圖6。

圖6 阿魏菇多糖AFM分析圖Fig.6 AFM analysis of mushrooms polysaccharide

從純品阿魏菇多糖組分AFM分析圖像中可以看出多糖分子鏈呈現(xiàn)出分枝結構，糖鏈的密度依賴于其初始密度及其沉積到云母片表面的量；圖像的對比度依賴于針尖的作用力，作用力太大易損壞糖鏈，而太小則對比度差，難得到較清晰、穩(wěn)定的圖像。從圖像中可以看到，多糖分子鏈及其多個側鏈結構，這些側鏈結構鏈間通過單元間不同的鏈接方式衍生出環(huán)狀結構，而鏈呈多股緊密的螺旋狀結構可能與多糖中分子間的Vander Waals相互作用以及糖鏈間氫鍵締合有關。

2.8 多糖電泳結果

多糖電泳結果見圖7。

圖7 阿魏菇多糖電泳結果圖Fig.7 Electrophoresis results of mushrooms polysaccharide

聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果表明，阿魏菇多糖呈區(qū)帶相對集中。阿魏菇多糖C為均一組分，達到了電泳純級的樣品。

3 結論

本文以阿魏菇為研究對象，對其粗多糖的制備，多糖的分離與純化，多糖的純度鑒定進行了系統(tǒng)的研究，同時利用薄層分析法，紅外分析，電泳，AFM等一系列方法分析研究其多糖的組分及結構。阿魏菇總多糖進行除蛋白后，通過薄層色譜分析出總多糖可能由半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖組成，通過DEAE-52 Cellulose凝膠柱及Sephadex G-100凝膠柱分離純化出阿魏菇純品多糖C。將多糖C進行聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，表明其為均一組分。同時進行了紅外光譜和原子力分析，表明阿魏菇多糖分子具有高度分枝的結構。

4 討論

阿魏菇是新疆特有的菌類之一，來源豐富，阿魏菇多糖的提取分離具有一定的可信性和可行性。多糖類化合物由于它們的獨特功能和很低的毒性在腫瘤的治療和預防上優(yōu)于其它化合物，因此多糖作為藥品或保健食品的應用將有廣闊前景。隨著對多糖生物活性的研究，尤其是糖組學的進一步深入，多糖的生物活性機理、功效因子會更加明確，它的應用領域將會更加拓寬。

有關本實驗的多糖研究方法還有很多，不同的研究方法可能會得到部分的差別，由于時間和條件的限制，本試驗只是初步的研究，還有待進一步的研究與探討。

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