超聲波輔助提取明日葉查爾酮的工藝優(yōu)化

寧鴻珍，陳欣華，王曼曼，王茜，劉楠，馬東，王丹丹，高勝海

（河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北省煤礦衛(wèi)生與安全實(shí)驗(yàn)室，河北唐山063000）

明日葉（Angelica keiskei）又名八丈芹，長壽菜，海峰人參，是傘形科多年生草本植物，原產(chǎn)于日本國伊豆、八丈諸島[1]。明日葉被譽(yù)為“21世紀(jì)的健康食品”，富含多種維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分和查爾酮等生物活性物質(zhì)[2]，在營養(yǎng)和醫(yī)療保健方面有重要功能，作為綠色食品具有廣闊的發(fā)展前景。查爾酮是植物體內(nèi)合成黃酮的前提，是一種重要的植物色素，其基本骨架為1，3-二苯基丙烯酮[3]。據(jù)報(bào)道[4-8]，查爾酮對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用、還有強(qiáng)烈的抗菌作用、同時(shí)有抗衰老、抗血栓、降血壓、抗過敏、抗癌、抗艾滋病、防癡呆癥、防糖尿病等諸多功效，也常被用做利尿通便劑、興奮劑和催乳劑，具有很高的醫(yī)學(xué)研究價(jià)值。目前，國內(nèi)外對(duì)明日葉中查爾酮的提取大多采用的是溶劑浸提法，但暴露出很多問題，如能量消耗大、提取時(shí)間長、提取率低等問題，而新興技術(shù)如超聲波提取技術(shù)、微波提取技術(shù)等具有簡單方便、提取時(shí)間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，目前尚未見超聲波輔助提取明日葉中查爾酮的工藝研究報(bào)道。本文采用超聲波輔助提取工藝對(duì)明日葉中的查爾酮進(jìn)行提取研究，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件[9]，并對(duì)明日葉中查爾酮含量進(jìn)行測定，為明日葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明日葉：購自山東明日葉莊園；查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品：由上海阿達(dá)瑪斯有限公司生產(chǎn)；無水乙醇和石油醚均為分析純：由天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純：購于Sigma公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；EYELER離心濃縮儀：日本東京理化器械株式會(huì)社；LGJ-12冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 查爾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

確稱取查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容50 mL容量瓶中，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，配置成 1、2、5、10、20 μg/mL 的查爾酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外可見分光光度計(jì)分別對(duì)1、2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波段掃描，在308 nm處顯示最大吸收，并呈現(xiàn)出計(jì)量關(guān)系，選定308 nm為最大吸收波長。在波長為308 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立吸光度和濃度之間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：y＝0.079 8x-0.011 1，R2＝0.999 5，如下圖1所示。

圖1 查爾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of chalcone

1.2.2 樣品處理

新鮮的明日葉莖葉用去離子水反復(fù)沖洗，沖洗后于50℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，粉碎，研磨，過40目篩。干燥至恒重，儲(chǔ)存于干燥器中備用。

1.2.3 明日葉中查爾酮的提取與測定

稱取0.5 g明日葉干粉，置于玻璃試管中，加入提取溶劑乙醇溶液[10]，水浴控溫，設(shè)定提取條件，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)明日葉查爾酮進(jìn)行輔助提取。提取液離心，取上清液，用2 mL～3 mL溶劑洗滌濾渣，離心，吸取上清液，合并提取液；利用石油醚反復(fù)萃取提取液[11]，去除其中的葉綠素，直至石油醚無色；將濾液離心濃縮，冷凍干燥，得到明日葉中查爾酮的粗提取物，用甲醇轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中作為待測溶液。取1 mL待測液用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用紫外一可見光分光光度計(jì)在308 nm波長下測定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算查爾酮得率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取明日葉干粉0.5 g，置于玻璃試管中，超聲波輔助提取，以明日葉查爾酮得率為指標(biāo)，分別研究超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)明日葉查爾酮得率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行5因素3水平正交試驗(yàn)，分析各因素影響的主次并確定其最優(yōu)提取工藝參數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)查爾酮提取效果的影響

超聲功率分別選用 100、200、300、400、500 W，實(shí)驗(yàn)在料液比1∶40、乙醇濃度為70%、冰浴、提取時(shí)間30 min（工作3 s，間歇5 s）的條件下進(jìn)行。

圖2 超聲功率對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extracting result

結(jié)果如圖2所示，隨著功率提高，吸光度上升，當(dāng)功率為300 W時(shí)，提取效果最好，隨后隨著功率的升高，提取效果反而下降。這可能是因?yàn)楣β侍髸r(shí)，超聲工作期間產(chǎn)熱越高，提取物被破壞，溶劑蒸發(fā)過快，導(dǎo)致提取效率下降。所以選擇300 W為最佳提取功率。

2.1.2 不同濃度乙醇對(duì)提取效果的影響

用于明日葉有效成分的提取溶劑有甲醇、正己烷、丙酮、乙醇等，由于甲醇、正己烷、丙酮、對(duì)人體健康不利，并且乙醇可有效降低查爾酮酶的活性，避免提取時(shí)查爾酮的分解，故選擇乙醇作為提取溶劑。適當(dāng)濃度的乙醇溶液可以大大增加提取物在提取液中的溶解度，從而減少溶劑用量，增大提取效率。實(shí)驗(yàn)分別選用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，其余條件為超聲功率300 W，料液比1∶40，冰浴，提取時(shí)間30 min（工作 3 s，間歇 5 s）。

圖3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extracting result

結(jié)果如圖3可知，明日葉中的查爾酮提取效果隨乙醇濃度的增加而升高，濃度達(dá)到70%時(shí)提取效果最好，之后提取效果反而下降了。這可能是由于乙醇濃度過高時(shí)，溶劑極性下降，查爾酮的溶解度下降，不利于查爾酮的溶出。同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，與查爾酮競爭與溶劑的結(jié)合，從而導(dǎo)致提取效果下降。

2.1.3 不同提取溫度對(duì)提取效果的影響

合適的提取溫度能加快提取物的溶出，但溫度過高，不僅增大了能耗，還有可能導(dǎo)致提取物的分解，從而降低了提取效率。實(shí)驗(yàn)在超聲功率300 W，料液比1 ∶40，乙醇濃度 70%，提取時(shí)間 30 min（工作 3 s，間歇5 s）的條件下，分別探討 50、60、70、80 ℃的提取溫度對(duì)提取效率的影響。

圖4 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the extracting result

結(jié)果如圖4所示，明日葉中的查爾酮提取效果隨提取溫度的上升而升高，溫度達(dá)到70℃時(shí)提取效果最好，之后提取效果反而下降，故選擇70℃為最佳提取溫度。

2.1.4 不同料液比對(duì)提取效果的影響

料液比高必然會(huì)增大兩相間濃度差，增大傳質(zhì)推動(dòng)力，提取效率也會(huì)相應(yīng)增大，但也會(huì)提高生產(chǎn)成本及增加后續(xù)處理的難度。在超聲功率為300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為70℃，提取時(shí)間30 min（工作3 s，間歇5 s）的實(shí)驗(yàn)條件下，料液比分別選用 1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖5 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on the extracting result

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨料液比的增大，提取效果越好，但當(dāng)液料比達(dá)到1∶40后，增加緩慢，考慮到提取率、生產(chǎn)成本和后續(xù)處理難度的問題，實(shí)驗(yàn)確定最佳料液比為1∶40。

2.1.5 不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

實(shí)驗(yàn)在超聲功率300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為70℃，液料比為1∶40的前提下，分別提取10、20、30、40、50 min（工作 3 s，間 5 s）。

圖6 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.6 Effects of extraction time on the extracting result

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，當(dāng)提取時(shí)間為10 min～20 min時(shí)，隨超聲波作用時(shí)間的延長，查爾酮吸光值逐漸增大，但超聲波處理時(shí)間超過20 min后吸光值有明顯下降，這可能是長時(shí)間處理導(dǎo)致溶劑揮發(fā)的緣故，當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，提取效果最好。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間按5因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定超聲輔助提取明日葉中查爾酮的最佳工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

由表2的極差分析和表3的方差分析結(jié)果可知，料液比對(duì)明日葉查爾酮提取量影響最大，其次為乙醇濃度和提取溫度，提取時(shí)間和超聲功率對(duì)其影響較小。表3方差分析結(jié)果表明：在95%置信水平下，從明日葉提取查爾酮的工藝參數(shù)中，功率和時(shí)間對(duì)明日葉提取效率影響不顯著，濃度、溫度和料液比影響顯著。綜合極差分析和方差分析可知本實(shí)驗(yàn)的最佳工藝為A2B2C1D3E2，即超聲波功率300 W，乙醇濃度為70%，提取溫度為50℃，料液比為1∶50，超聲時(shí)間為20 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance

2.3 工藝驗(yàn)證

取3份試樣各0.5 g，按最佳提取方法進(jìn)行提取，吸光值分別為1.096，1.110，1.104。計(jì)算得明日葉中查爾酮得率為6.98 mg/g。均高于正交試驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組合的查爾酮得率，與正交試驗(yàn)分析結(jié)果相符。

2.4 明日葉中查爾酮提取率的測定

在最佳的提取工藝條件下，對(duì)明日葉中的查爾酮的提取率進(jìn)行測定。結(jié)果見圖7。

圖7 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.7 Effects of extracting times on the extracting result

由圖7可知，隨著提取次數(shù)的增加，查爾酮的提取率也增加。但提取次數(shù)超過2次后，查爾酮的提取率增加很少，所以在最佳的提取工藝條件下，提取2次后吸光值為1.191，明日葉查爾酮的得率為7.53 mg/g。

3 結(jié)論

本文所探討的5個(gè)因素超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間，對(duì)明日葉查爾酮提取量的影響主次順序是：料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞超聲功率。提取工藝條件為超聲波功率300 W，乙醇濃度70%，提取溫度為50℃，料液比為1∶50，提取時(shí)間為20 min。在此條件下提取2次，明日葉中查爾酮得率為7.53 mg/g。

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