超聲波輔助提取新疆阿魏菇蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化

牛博楠，許程劍，劉冰，何月，王思月

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

阿魏菇（Pleurotus ferulae）是新疆特有的菌類(lèi)，其因寄生或腐生在中藥阿魏肥大的根莖部而得名。在我國(guó)阿魏菇僅分布于新疆荒漠地區(qū)的木壘、托里、阿勒泰、伊梨、塔城等地，與其寄主阿魏的分布是一致的[1]。阿魏菇集食用、藥用、美容于一身，營(yíng)養(yǎng)豐富全面并且各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量都很高[2-3]，被譽(yù)為當(dāng)今食用菌“皇后”。阿魏菇菇體潔白高大，肉質(zhì)細(xì)膩鮮嫩，味美可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量占干菇的20%，含有18種氨基酸，人體8種必需氨基酸全部具備。其除含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸外，還含有豐富的維生素（主要含VD）、食用纖維，并富含鈣、鐵、鋅、錳等多種礦質(zhì)元素和微量元素。阿魏菇還在抗腫瘤，抗疲勞，抗誘變，免疫調(diào)節(jié)[3-5]等各方面都有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏菇（新疆清河）；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、無(wú)水乙醇、磷酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸 均為分析純。

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV759紫外可見(jiàn)分光光度器：上海精科；BS2000電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LG100B鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠；Neofuge15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：香港力康；打漿機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 阿魏菇蛋白提取的工藝流程

新鮮阿魏菇——洗凈切片——打漿——超聲波浸提——離心——上清液考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量

1.2.2.1 阿魏菇

選擇成熟適當(dāng)，菇體潔白，新鮮無(wú)異味的阿魏菇，清洗后切片，用保鮮膜包裹后存放于4℃冰箱中。

1.2.2.2 打漿

稱取適當(dāng)阿魏菇，用剪刀剪碎，加入等質(zhì)量的蒸餾水，打漿3 min。

1.2.2.3 離心

將浸提后的漿體以7 000 r/min下離心15 min。

1.2.3 阿魏菇總蛋白含量的測(cè)定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，運(yùn)用凱氏定氮法測(cè)定阿魏菇中蛋白的含量。

1.2.4 提取工藝

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

選擇影響蛋白得率的幾個(gè)因素：超聲溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）、液料比（2、3、4、5、6 mL/g）、超聲 時(shí) 間（2、5、10、15、20 min）、pH（9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察各因素對(duì)阿魏菇蛋白得率的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選取對(duì)阿魏菇蛋白得率影響大的3個(gè)因素，采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert.8.05建立三因素五水平的Central Composite模型，通過(guò)試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝。變量因素編碼及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面自變量因素編碼及水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.2.5 阿魏菇蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

將堿溶的上清液的 pH 分別調(diào)到 2.5、3、3.5、4、4.5、5，靜置30 min，離心，測(cè)定上清液蛋白含量，蛋白含量最少的即為阿魏菇蛋白的等電點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)品，繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，建立的回歸方程為y=0.007 8x+0.017 7，其中y為595 nm處測(cè)得的吸光度，x為BSA 的濃度（μg/mL），R2=0.998 4。

圖1 蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of protein content

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波溫度對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響

在pH為9，超聲時(shí)間為30 min，液料比為4 mL/g，超聲溫度對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 超聲溫度對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic temperature on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

從圖2可以看出，阿魏菇蛋白的得率隨著超聲溫度的提高呈上升趨勢(shì)，在溫度30℃時(shí)提取率達(dá)到最大11.093%，超聲溫度繼續(xù)升高時(shí)，阿魏菇提取率呈明顯的下降趨勢(shì)，可能是由于蛋白質(zhì)在高于30℃后容易受熱導(dǎo)致變性，使有些已水解的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和聚合，反而降低蛋白的溶解度[6]。

2.2.2 液料比對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，超聲時(shí)間30 min，pH9，液料比對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of Liquid ratio on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

如圖3所示，隨著液料比的增大，阿魏菇蛋白提取率呈上升趨勢(shì)，在液料比為4 mL/g時(shí)達(dá)到最大11.733%，當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，蛋白提取率趨于穩(wěn)定。過(guò)大的液料比增加水的用量和后續(xù)濃縮難度[7]，選擇最適液料比為4 mL/g。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，液料比4 mL/g，pH9，超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

由圖4可知，阿魏菇蛋白提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)時(shí)間到達(dá)10 min時(shí)提取率率達(dá)到最大為15.638%，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，提取率明顯降低，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲空化作用導(dǎo)致蛋白變性[8]，使提取率降低。

2.2.4 pH對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，超聲時(shí)間10min，液料比4mL/g，pH對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5 pH對(duì)阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.5 Influence of pH on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

圖5可以看出，阿魏菇蛋白的提取率隨著pH的增大而增大，當(dāng)pH到達(dá)10時(shí)出現(xiàn)了第一個(gè)高峰，隨著pH的繼續(xù)增大，蛋白提取率呈下降趨勢(shì)，之后又有緩慢的上升趨勢(shì)。但pH由12再繼續(xù)增大時(shí)，蛋白提取率增大明顯。但考慮到隨著pH的增大，氨基酸之間有可能發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生異味[9]使蛋白變性，綜合考慮，選擇最適pH為10。

2.3 阿魏菇蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果

上清液中蛋白含量越少表明沉降的蛋白量越多，由圖6可以看出，阿魏菇蛋白的等電點(diǎn)為pH4。

圖6 阿魏菇蛋白等電點(diǎn)的精確測(cè)定Fig.6 The accurate determination of isoelectric point on Pleurotus ferulae protein

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化分析

表2 工藝參數(shù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results in response surface test of process parameters

表3 蛋白質(zhì)提取率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance to the extraction ratio of protein

對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[9]，得到了阿魏菇蛋白提取率對(duì)超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）的二次多項(xiàng)式的回歸模型如下：

得率=16.91-0.034A-0.94B+0.83C-0.29AB-0.47AC-0.75BC-1.50A2-1.42B2-0.59C2

由表3中的回歸模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失擬項(xiàng)的 P=0.216 3＞0.05，不顯著，表明建立的該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)阿魏菇蛋白提取的工藝參數(shù)。同時(shí)由表3中的回歸模型顯著性分析可知，B、C、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)阿魏菇蛋白得率的影響顯著，A、AB對(duì)阿魏菇蛋白得率的影響不顯著。

由圖8可得，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明超聲時(shí)間和液料比之間的交互作用顯著，由超聲時(shí)間和液料比的3D圖可看出，阿魏菇蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較顯著，與回歸模型的方差分析結(jié)果相符。

由圖9可得，超聲溫度和液料比的等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明兩者之間的交互作用較顯著，并且由超溫度和液料比的3D圖可知，阿魏菇蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，液料比對(duì)其影響較大，兩者之間的交互作用較顯著。

2.5 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

圖7 時(shí)間與溫度互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Curved surface chart of time and temperature

圖8 時(shí)間與液料比互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.8 Curved surface chart of time and liquid to solid ratio

圖9 溫度與液料比互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.9 Curved surface chart of temperature and liquid to solid ratio

由模型方程計(jì)算可得，阿魏菇蛋白提取率的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案為pH10、超聲溫度27.09℃、超聲時(shí)間9.45 min、液料比5mL/g，在此條件下的蛋白提取率的理論值達(dá)到17.68%。根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際情況將實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整為pH10、超聲溫度27℃、超聲時(shí)間10min、液料比5mL/g，重復(fù)試驗(yàn)3次，最終得到的阿魏菇蛋白提取率的平均值為17.59%，與理論值基本一致。結(jié)果表明，該模型可以較好地反映出阿魏菇蛋白提取的條件，從而也證明了響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取阿魏菇蛋白條件參數(shù)的可行性。

3 結(jié)論

采用Central Composite設(shè)計(jì)，建立了超聲波輔助堿溶酸沉法提取阿魏菇中蛋白質(zhì)工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)阿魏菇蛋白的提取率。阿魏菇蛋白提取的優(yōu)化工藝條件為pH10、超聲溫度27℃、超聲時(shí)間10 min、液料比5 mL/g，提取率達(dá)到17.59%。

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