原花青素對急性脊髓損傷大鼠核因子-кB和白細胞介素-6表達的影響

馬延仃，謝少華，楊拯，楊海燕，李曉，張藝，梁羽，郭秀娟，張奇蘭，張曉

原花青素對急性脊髓損傷大鼠核因子-кB和白細胞介素-6表達的影響

馬延仃，謝少華，楊拯，楊海燕，李曉，張藝，梁羽，郭秀娟，張奇蘭，張曉

目的觀察原花青素對脊髓損傷后大鼠核因子-кB(NF-кB)、白細胞介素-6(IL-6)表達變化的影響。方法36只健康成年Sprague-Dawley大鼠均分為3組：原花青素治療組(A組)、甲基潑尼松龍治療組(B組)和對照組(C組)。采用Allen法復制大鼠T9急性脊髓損傷模型，于術后1 d、3 d和7 d對各組大鼠行后肢運動功能BBB評分和斜板試驗；免疫組織化學染色檢測脊髓NF-кB和IL-6的表達。結果術后3 d、7 d，A組、B組大鼠BBB評分和斜板試驗成績均優(yōu)于C組(P＜0.05)。A組術后各時間點NF-кB表達均明顯低于C組(P＜0.01)，B組術后3 d、7 d的NF-кB表達強度明顯低于C組(P＜0.01)。術后各時間點，A、B兩組IL-6表達均低于C組(P＜0.05)。結論原花青素可抑制脊髓損傷后大鼠脊髓組織NF-кB、IL-6的表達，有效抑制炎癥反應，從而促進大鼠后肢運動功能的恢復。

脊髓損傷；原花青素；運動功能；核因子-кB；白細胞介素-6；大鼠

[本文著錄格式]馬延仃，謝少華，楊拯，等.原花青素對急性脊髓損傷大鼠核因子-кB和白細胞介素-6表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(8):713-717.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)導致原發(fā)性脊髓組織壞死和繼發(fā)性損傷，嚴重影響患者的生活質量。研究表明，炎癥反應在脊髓繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用[1]；如何有效控制脊髓損傷后的早期炎癥反應，降低繼發(fā)性損傷的程度，是保存脊髓功能、改善預后的關鍵[2]。原花青素(proanthocyanidin)是一種廣泛存在于自然界植物中的多酚化合物，由不同數量的兒茶素或表兒茶素縮合而成。原花青素是清除人體內自由基十分有效的天然抗氧化劑，在抗脂質過氧化和清除自由基，保護心血管、抗炎、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用[3-5]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌雄不限，體質量(200±20)g，由成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2008-24。

1.2 試劑和儀器

原花青素購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號：120614。注射用甲基潑尼松龍琥珀酸鈉購自天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：10031501。注射用青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠，批號：A120802810。氯化鈉注射液購自貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：B121003U。戊巴比妥鈉(德國進口分裝)購自北京化學試劑公司，批號：100808。兔抗鼠核因子-кB(nuclearfactor kappa B,NF-кB)多克隆抗體(批號：D-C1-07C14B)、SV0002-6兔IgG兩步法免疫組化試劑盒(批號：07E04AJ)、DAB顯色試劑盒(批號：07D16B22)，購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗鼠白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司，批號：YEYE22W。BX53F正置熒光顯微鏡(SN：IE38873，日本)。Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件：USA Media Cybernetics。自制數字式脊髓損傷動物模型制備儀。

1.3 造模與分組

將大鼠以1.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術臺上。背部去毛、消毒鋪巾，正中切口顯露椎板和棘突，確定T9位置。小心分離并咬除T9棘突，剝離椎板，適當暴露脊髓。采用Allen法以10×25 g?mm能量打擊脊髓。大鼠即刻出現脊髓打擊處充血、尾巴擺動及雙下肢不同程度抽搐現象為打擊成功標志。逐層消毒并縫合切口，0.9%氯化鈉注射液9 ml/kg腹腔注射補液，8×104U青霉素鈉腹腔注射預防感染。術后大鼠獨籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，保持適宜環(huán)境，每天3次擠壓排尿，直至大鼠能自主排尿。

36只大鼠均分為三組。造模成功后30min，原花青素治療組(A組)腹腔注射原花青素40 mg/kg，以后每天1次。甲基潑尼松龍治療組(B組)腹腔注射甲基潑尼松龍30 mg/kg，以后每6 h注射1次，每次5.4 mg/ kg，共4次。對照組(C組)注射等體積生理鹽水，每天1次。

1.4 運動功能觀察

于造模后1 d、3 d、7 d，各組選取4只大鼠，進行以下測試。

1.4.1 BBB評分[6]大鼠置于寬敞場地，由對分組不知情的兩人觀察其后肢運動狀況4min，評定BBB評分。取雙后肢評分的均值作為評分結果，最終評分值為兩評測人員評分的均值。

1.4.2 斜板試驗[7]大鼠置于墊有橡膠墊的自制木料斜板上，頭朝向斜板抬高側，身體縱軸與斜板縱軸一致。斜板傾斜角度從0°開始緩慢增大，每次增加1～2°，記錄大鼠在斜板上能停留并保持至少5 s時的最大角度。由對分組不知情的兩人對每只大鼠測定3次，取均值。最終結果取兩人結果的均值。

1.5 組織取材與切片制備

每組各取4只大鼠，于運動功能評測后，以1.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。打開胸腔，充分暴露心臟和主動脈根部。從左心室插管到主動脈根部，剪開右心耳，經左心室快速灌注肝素生理鹽水約200 ml，至肝臟及鞏膜蒼白。4%多聚甲醛150～200 ml灌注40min。以損傷處為中心切取脊髓組織約1 cm，4%多聚甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)橫切，厚5μm，用于免疫組織化學染色。

1.6 免疫組織化學染色

切片常規(guī)脫蠟水化，置3%H2O2中孵育10min；水洗3次，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓修復90 s。冷卻至室溫后滴加封閉液，室溫下封閉10min。甩去多余液體后，滴加適當稀釋的一抗(兔IgG) 4℃過夜，用PBS替代一抗作為陰性對照。NF-кB一抗和IL-6一抗的稀釋度分別為1∶200、1∶100。切片復溫后，1 mol/L PBS洗滌3次，滴加聚合HRP標記抗兔IgG于37℃中孵育40min，PBS洗滌3次。DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察，免疫陽性反應呈棕黃色或棕褐色。每張切片400倍下隨機拍攝5個無重復的視野，采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件測定每個視野中累積光密度(IOD SUM)和其分布面積(area SUM)，計算平均光密度(AOD)：

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BBB評分

術前各組大鼠運動功能正常，評分均為21分。術后1 d，A組評分與C組無顯著性差異(P＞0.05)。術后3 d、7 d，A、B組評分與C組相比均升高(P＜0.05)。見表1。

2.2 斜板試驗

術后1 d，A組與C組無顯著性差異(P＞0.05)。術后3 d、7 d，A、B組角度與C組相比均增大(P＜0.05)。見表2。

2.3 NF-кB的表達

C組大鼠術后NF-кB表達明顯，且隨時間延長呈增強趨勢。A、B組術后也有大量NF-кB表達。術后1 d，B組表達與C組無顯著性差異(P＞0.05)。術后3 d、7 d，A、B組表達強度與C組相比均明顯降低(P＜0.01)。從結果可看出，A組術后1 d、3 d的NF-кB表達有弱于B組的趨勢。見表3、圖1。

2.4 IL-6的表達

A、B組各時間點IL-6表達均低于C組(P＜0.05)。A組術后1 d、3 d時IL-6表達有弱于B組的趨勢。見表4、圖2。

表1 各組大鼠BBB評分

表2 各組大鼠斜板試驗結果(°)

表3 各組大鼠脊髓組織NF-кB表達(AOD,×10-4)

表4 各組大鼠脊髓組織IL-6表達(AOD,×10-4)

圖1 各組大鼠脊髓組織NF-кB的表達(免疫組織化學染色，400×)

圖2 各組大鼠脊髓組織IL-6的表達(免疫組織化學染色，400×)

3 討論

脊髓損傷后繼發(fā)性損傷出現于原發(fā)性損傷后數分鐘內，包括損傷局部缺血缺氧、脂質過氧化、鈣離子內流、自由基損傷、興奮性毒性及免疫炎性反應等，可持續(xù)數周至數月，所造成的危害遠大于原發(fā)性損傷。但其機制眾說紛紜。

近年來有學者提出，脊髓損傷后的免疫炎性反應可能是繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)生機制的核心，是繼發(fā)性脊髓損傷中其他各種損傷機制的源頭，其他各種損傷機制只是免疫炎性反應機制的下游過程或結果[8]。脊髓損傷后，外源性炎性細胞活化并穿過血腦屏障，遷移、浸潤到損傷區(qū)，同時活化膠質細胞，釋放大量炎性因子加重炎癥反應，發(fā)揮神經毒性作用，造成神經元和少突膠質細胞凋亡、壞死，受損脊髓局部空洞和膠質瘢痕形成等一系列病理改變[9]。有效抑制脊髓損傷后過度的炎癥反應一直是研究的熱點。

NF-кB是眾多細胞因子和炎癥介質表達的主要轉錄因子，在細胞炎性反應、神經營養(yǎng)因子的調節(jié)、巨噬細胞活化、細胞凋亡[10-11]等過程中起著重要作用。NF-кB被激活是急性脊髓損傷繼發(fā)性損傷的重要分子機制。急性脊髓損傷后NF-кB表達的大幅度上調既可促使腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1等促炎因子基因過度表達，又是IL-1β和TNF-α表達誘導的結果。這個能放大且延續(xù)炎癥反應的正反饋環(huán)導致廣泛促炎基因表達，加重炎癥反應和對損傷脊髓的損害。研究表明，阻斷NF-кB的活化可減輕脊髓損傷后引起的一系列繼發(fā)性損傷[12]；NF-кB亞基的不同組合形式在炎癥反應中充當不同角色[13-14]。研究顯示，急性脊髓損傷后6 h，白質內膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達開始增強；5 d時灰白質內GFAP陽性細胞仍大量存在，而NF-кB表達在急性脊髓損傷后1 h可檢測到，5 d時明顯減弱[15]；抑制星形膠質細胞中的NF-кB，炎性反應得到減弱，脊髓功能恢復較好[16]。推測NF-кB可能參與脊髓損傷后GFAP的表達，調節(jié)反應性膠質增生，控制炎癥反應。

炎性細胞因子可調控巨噬/小膠質細胞的自身活化及極化狀態(tài)，影響神經再生和功能[17-18]。其中，具有致炎和抗炎雙向功能的白介素家族成員IL-6不可忽視，但其在脊髓繼發(fā)性損傷過程中的角色存在爭議。有學者認為，IL-6加重脊髓繼發(fā)性損傷。脊髓損傷早期損傷區(qū)增多的IL-6可促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，進而促進炎性細胞浸潤到損傷局部，抑制神經功能的恢復[19-20]。研究顯示，IL-6的短暫阻滯可下調脊髓損傷早期其他炎癥因子的表達，減輕炎癥反應，促進功能恢復[21]。雖然研究已表明IL-6在脊髓損傷早期主要發(fā)揮其致炎作用，但作用機制尚不清楚。另有學者提出，IL-6可減輕脊髓繼發(fā)性損傷，在一定程度上保護受損脊髓。脊髓損傷后30min全身應用IL-6，可使Bcl-2表達明顯增強，而Fas表達減弱，推測IL-6可有效調控神經細胞的凋亡，減輕繼發(fā)性損傷[22]。

本研究結果顯示，術后3 d、7 d，原花青素治療大鼠運動功能恢復較好。術后1 d、3 d、7 d，原花青素治療大鼠脊髓組織中NF-кB和IL-6的表達均明顯減弱。推測原花青素可通過抑制NF-кB、IL-6的表達，有效控制脊髓損傷后的炎癥反應，進而促進大鼠運動功能的恢復。

對于有爭論的IL-6，本實驗結果表明，在一定程度上抑制脊髓損傷后IL-6的過度表達可促進大鼠后肢運動功能恢復，脊髓損傷后過度表達的IL-6參與炎癥反應及脊髓繼發(fā)性損傷。本研究還發(fā)現，原花青素在術后1 d、3 d對NF-кB和IL-6的表達抑制情況有強于甲基潑尼松龍的趨勢，說明原花青素可能具有較好的抑制脊髓損傷后早期炎癥反應的作用。

原花青素作為一種高效、低毒、高生物利用度、強抗氧化活性和自由基清除功能等多種良好生物活性的天然提取物，已在歐洲、美國、日本等國家和地區(qū)廣泛應用于食品、保健、藥品等領域[23-24]，具有巨大的研究價值和開發(fā)潛力。然而，目前對原花青素的藥理作用及其機制研究不夠全面深入，臨床使用的原花青素藥品少見。本研究結果顯示，原花青素可抑制脊髓損傷后的炎癥反應，有效促進大鼠運動功能的恢復，說明原花青素在脊髓損傷的治療中有廣闊前景。我國擁有漫長的中醫(yī)藥研究歷史和豐富的原花青素植物資源，充分發(fā)揮我國優(yōu)勢開展相關原花青素研究和開發(fā)，將為臨床脊髓損傷的藥物治療提供新思路。

[1]Whalley K,O'Neill P,Ferretti P.Changes in response to spinal cord injury with development:vascularization,hemorrhage and apoptosis[J].Neuroscience,2006,137(3):821-832.

[2]許春財,許衛(wèi)紅.脊髓損傷后神經細胞繼發(fā)壞死機制研究進展[J].中國當代醫(yī)藥,2011,18(16):18-19,25.

[3]謝少華,楊拯,龔都,等.原花青素對脊髓損傷大鼠運動功能的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(9):831-833.

[4]Bogs J,Downey MO,Harvey JS,et al.Proanthocyanidin synthesis and expression of genes encoding leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase in developing grape berries and grapevine leaves[J].Plant Physiol,2005,139(2):652-663.

[5]張妍,吳秀香.原花青素研究進展[J].中藥藥理與臨床,2011, 27(6):112-116.

[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC,et al.MASCIS evaluation of open field locomotor scores:effects of experience and teamwork on reliability Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study[J].J Neurotrauma,1996,13(7):343-359.

[7]Rivin AS,Tator CH.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat[J].J Neurosurg,1977,47(4):577-581.

[8]王建民,唐開.免疫炎性反應在繼發(fā)性脊髓損傷中作用的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2012,18(3):350-353.

[9]張海燕,楊朝陽,李曉光.大鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成的病理學規(guī)律[J].中國康復理論與實踐,2011,17(3):215-218.

[10]Lawrence T,Fong C.The resolution of inflammation:anti-inflammatory roles for NF-kappa B[J].Int J Biochem Cell Biol, 2010,42(4):519-523.

[11]鄭晶晶,姚安會,劉芳芳,等.小鼠脊髓損傷早期不同炎癥因子的表達變化[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(4):391-394.

[12]吳俊,梁維邦,倪紅斌,等.促紅細胞生成素對大鼠急性脊髓損傷后核因子κB及炎癥因子表達的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2011, 37(4):381-383.

[13]Fong CH,Bebien M,Didierlaurent A,et al.An anti-inflammatory role for IKKbeta through the inhibition of"classical"macrophage activation[J].J Exp Med,2008,205(6):1269-1276.

[14]Greten FR,Arkan MC,Bollrath J,et al.NF-кB is a negative regulator of IL-1β secretion as revealed by genetic and pharmacological inhibition of IKKβ[J].Cell,2007,130(5):918-931.

[15]扈玉華,張慶俊,史學芳.急性脊髓損傷時核因子кB與膠質原纖維酸性蛋白相關性研究[J].河北醫(yī)藥,2002,24(10):772-774.

[16]Brambilla R,Bracchi-Ricard V,Hu WH,et al.Inhibition of astroglial nuclear factor kappa B reduces inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury[J].J Exp Med,2005,202(1):145-156.

[17]Leal-Filho MB.Spinal cord injury:from inflammation to glial scar[J].Surg Neurol Int,2011,2:112.

[18]David S,Kroner A.Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal cord injury[J].Nat Rev Neurosci,2011, 12(7):388-399.

[19]Mukaino M,Nakamura M,Yamada O,et al.Anti-IL-6-receptor antibody promotes repair of spinal cord injury by inducing microglia-dominant inflammation[J].Exp Neurol,2010,224 (2):403-414.

[20]Pineau I,Sun L,Bastien D,et al.Astrocytes initiate inflammation in the injured mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory monocytes in an IL-1 receptor/ MyD88-dependent fashion[J].Brain Behav Immun,2010,24 (4):540-553.

[21]Guerrero AR,Uchida K,Nakajima H,et al.Blockade of interleukin-6 signaling inhibits the classic pathway and promotes an alternative pathway of macrophage activation after spinal cord injury in mice[J].J Neuroinflammation,2012,9:40.

[22]布林,鐘環(huán),陳繼銘.白細胞介素-6對大鼠脊髓損傷后神經細胞凋亡的影響[J].醫(yī)藥產業(yè)資訊,2005,2(14):6-7.

[23]Lee KW.功能性美容食品的健康作用[C]//中國營養(yǎng)學會,韓國食品科學會.2012年第二屆中韓植物化學物國際學術研討會論文集,2012:20.

[24]官清,張珩,石曉琳.原花青素藥用研究進展[J].臨床合理用藥雜志,2012,5(4):174-175.

Effect of Proanthocyanidin on Expression of Nuclear Factor kappa B and Interleukin-6 in Rats after Spinal Cord Injury

MA Yanding,XIE Shao-hua,YANG Zheng,YANG Hai-yan,LI Xiao,ZHANG Yi,LIANG Yu,GUO Xiu-juan,ZHANG Qi-lan,ZHANG Xiao.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

ObjectiveTo observe the effect of proanthocyanidin on the expression of nuclear factor kappa B(NF-кB)and interleukin-6 (IL-6)in rats with spinal cord injury(SCI).Methods36 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into proanthocyanidin treatment group(group A,n=12),methylprednisolone(MP)treatment group(group B,n=12)and model control group(group C,n=12).Allen's method was used to establish the model of acute spinal cord injury in T9.On the 1st,3rd and 7th days after operation,4 rats in each group were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scale and Slanting Board Test(SBT),and the expression of NF-кB and IL-6 of the spinal cord were detected with immunohistochemistry.ResultsThe scores of BBB and SBT were better in groups A and B than in the group C 3 and 7 days after SCI(P＜0.05).Compared with group C,the expression of NF-кB in group A decreased all the time after SCI(P＜0.01),and 3 and 7 days after SCI in group B(P＜0.01);while the expression of IL-6 decreased all the time after SCI in groups A and B(P＜0.05).ConclusionProanthocyanidin may inhibit the expression of NF-кB and IL-6 in spinal cord after SCI in order to reduce inflammation and improve the hindlimb motor function in rats after SCI.

spinal cord injury;proanthocyanidin;motor function;nuclear factor kappa B;interleukin-6;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.003

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0713-05

2013-06-28

2013-07-25)

1.2013年國家級大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(No.201313705002)；2.成都醫(yī)學院大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(No.CXXS201307)。

成都醫(yī)學院，四川成都市610500。作者簡介：馬延仃(1992-)，女，漢族，河南汝州市人，大學本科生。通訊作者：張奇蘭、楊拯。E-mail:yzixjj@163.com(楊拯)。