人工淚滴眼液無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的探討

宮瑞中王 麗王峻峰張 琳冀 明王 婧鄧自新程愛(ài)華

（1 山西省眼科醫(yī)院，山西 太原 030002；2 山西省藥檢所，山西 太原 030001）

人工淚滴眼液無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的探討

宮瑞中1王 麗1王峻峰1張 琳1冀 明1王 婧1鄧自新2程愛(ài)華2

（1 山西省眼科醫(yī)院，山西 太原 030002；2 山西省藥檢所，山西 太原 030001）

目的 建立我院制劑人工淚滴眼液的無(wú)菌檢查法。方法 依據(jù)《中國(guó)藥典）2010年版二部附錄ⅪH無(wú)菌檢查法，分別采用直接接種法、薄膜過(guò)濾法對(duì)人工淚滴眼液進(jìn)行無(wú)菌檢查方法研究。結(jié)果 直接接種法與薄膜過(guò)濾法都滿足驗(yàn)證要求，但因我院制劑人工淚滴眼液為微黏稠澄明液體，薄膜過(guò)濾法不易操作，過(guò)濾困難，而直接接種法方便操作的同時(shí)還可以定量計(jì)算污染率。結(jié)論 直接接種法可以作為我院制劑人工淚滴眼液進(jìn)行無(wú)菌檢查的首選方法。

人工淚滴眼液；直接接種法；薄膜過(guò)濾法；方法驗(yàn)證

我院制劑人工淚滴眼液用于無(wú)淚液患者及干燥性角膜炎、結(jié)膜炎，為了確保臨床用藥安全，需對(duì)其進(jìn)行無(wú)菌檢查。按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅪH無(wú)菌檢查法的要求[1,2]，我們分別采用直接接種法和薄膜過(guò)濾法對(duì)3批人工淚滴眼液進(jìn)行了無(wú)菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證[3]，結(jié)果表明我院制劑人工淚滴眼液采用直接接種法是行之有效的。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MJX-205B-Z型霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器（三洋電機(jī)株式會(huì)社）。

1.2 本實(shí)驗(yàn)所用菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（本實(shí)驗(yàn)所用菌株均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，均為第三代）。

1.3 培養(yǎng)基及試藥

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)12330）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)1203122）、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（批號(hào)1304102）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)120410）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)120515）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)120113），以上均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。人工淚滴眼液（批號(hào)20130603、20130607、20130613由山西省眼科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

驗(yàn)證環(huán)境為10000級(jí)潔凈條件下的局部100級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌室及潔凈臺(tái)按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果符合規(guī)定。

2.1 菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 mL中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取此培養(yǎng)物1 mL加0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液9 mL，10倍遞增稀釋至＜100 cfu/mL的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。具體見(jiàn)表1。

2.1.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，取此培養(yǎng)液1 mL加0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5，使菌數(shù)約＜100 cfu/mL。

2.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5 d，加入5 mL的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液制成每 1mL含孢子數(shù)＜100 cfu/mL的孢子懸液。

表1 驗(yàn)證試驗(yàn)用活菌計(jì)數(shù)

2.2 培養(yǎng)基適用性檢查

2.2.1 無(wú)菌性檢查

取上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基（每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取不少于5瓶）各制備成滅菌溶液，在相應(yīng)條件下培養(yǎng)14 d，結(jié)果表明為無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.2.2 靈敏度檢查

取裝有12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的試管9支，分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，32 ℃培養(yǎng)3 d；取5支裝量為9 mL的改良馬丁培養(yǎng)基，分別接種＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察結(jié)果。結(jié)果表明，加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，而空白對(duì)照管均無(wú)菌生長(zhǎng)，因此靈敏度檢查符合規(guī)定。見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 薄膜過(guò)濾法

①陽(yáng)性組：將制備好的各試驗(yàn)菌液分別接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基（50毫升/支）中。②試驗(yàn)組：取15支樣品，過(guò)濾于一次性三聯(lián)集菌器中，將樣品注入無(wú)菌氯化鈉注射液中，過(guò)濾，再用無(wú)菌氯化鈉注射液沖洗，在最后一次的沖洗液中加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌液1 mL，沖洗完后，將濾膜取下，接種至相應(yīng)培養(yǎng)基中。③樣品組：方法同試驗(yàn)組，但不加相應(yīng)的試驗(yàn)菌液。④陰性對(duì)照組：另取同批次的一支硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和一支改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。將上述各組置規(guī)定溫度下培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察，結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同對(duì)照組比較，含樣品的各組中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，并與各陽(yáng)性對(duì)照組中相應(yīng)的菌落生長(zhǎng)情況相似，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，表明樣品在此檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于人工淚滴眼液的性狀為無(wú)色的微黏稠澄明液體，難以通過(guò)濾膜，薄膜過(guò)濾法不易操作，影響試驗(yàn)的順利進(jìn)行，因此不建議采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行人工淚滴眼液的無(wú)菌檢查。

2.3.2 直接接種法

①試驗(yàn)組：取樣6支，其中4支每支取樣2 mL加至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基20 mL中，其余2支每支取樣2 mL加至改良馬丁培養(yǎng)基20 mL中，再分別加入6株試驗(yàn)菌。②陽(yáng)性組：另取一裝有同體積相應(yīng)培養(yǎng)基的試管，加入等量試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性組。③樣品組：分別取樣2 mL加至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。④陰性對(duì)照組：另取同批次的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。將上述各組置規(guī)定溫度下培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證試驗(yàn)各組生長(zhǎng)情況

結(jié)果表明，供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，可以按照直接接種法在該檢查條件下進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。因此直接接種法從檢驗(yàn)方法到實(shí)驗(yàn)操作上都適合人工淚滴眼液的無(wú)菌檢驗(yàn)。

3 結(jié) 論

綜上所述，按照《中國(guó)藥典》（2010年版）可采用直接接種法或薄膜過(guò)濾法進(jìn)行人工淚滴眼液的無(wú)菌檢查，在兩法的方法驗(yàn)證中，我院制劑人工淚滴眼液對(duì)對(duì)照菌均無(wú)抑制作用。鑒于人工淚滴眼液為微黏稠的液體，直接接種法與薄膜過(guò)濾法更加方便易行、污染概率小，且在方法驗(yàn)證后的大規(guī)模試驗(yàn)中能定量計(jì)算人工淚滴眼液的污染率，更能體現(xiàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，是我院制劑人工淚滴眼液無(wú)菌檢查的首選方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)附錄103[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 趙亞麗,吳英.雙黃連注射液無(wú)菌檢查的方法驗(yàn)證[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24(1):31-33.

[3] 李彩霞.參芪注射液無(wú)菌檢查的方法驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué),2010, 22(6): 35-36.

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1671-8194（2014）18-0089-02