復(fù)方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌主動外排泵影響的藥敏試驗(yàn)*

陳玉嬌 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050）

復(fù)方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌主動外排泵影響的藥敏試驗(yàn)*

陳玉嬌 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050）

目的觀察中藥復(fù)方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌（Ecl）主動外排泵機(jī)制的影響。方法（1）含藥血清的制備：選購健康大耳白兔，隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組6只和空白對照組6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)組予以無菌復(fù)方清熱顆粒劑藥液灌胃，每日2次，連續(xù)給藥5 d；對照組予同等體積滅菌蒸餾水灌胃相同時(shí)間及給藥次數(shù)。末次給藥后60 min，無菌心臟采血，分離含藥血清和空白血清，于-20℃保存?zhèn)溆?。?）應(yīng)用外排泵抑制劑碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）篩選出外排泵表型陽性多重耐藥Ecl 10株，利用瓊脂對倍稀釋法測出環(huán)丙沙星，對上述Ecl的最小抑菌濃度（MIC）值，并用同樣方法測出含藥血清、空白血清、復(fù)方清熱顆粒、CCCP及分別聯(lián)合環(huán)丙沙星對上述10株Ecl的最小抑菌濃度（MIC）值變化。結(jié)果復(fù)方中藥清熱顆粒含藥血清可降低環(huán)丙沙星對多重耐藥EclMIC值。結(jié)論中藥復(fù)方清熱顆可抑制多重耐藥Ecl的耐藥情況。

陰溝腸桿菌 主動外排泵 復(fù)方清熱顆粒

陰溝腸桿菌（Ecl）是一種重要的臨床條件致病菌，其所致感染約占腸桿菌屬感染的65％～75％［1］，主要引起菌血癥，呼吸道、泌尿道等感染。近年，由于長期和不合理廣譜抗生素的使用，多重耐藥（MDR）Ecl的出現(xiàn)越來越普遍［2］，導(dǎo)致ICU感染病死率增加，給臨床治療帶來了極大困難［3］。本院中藥復(fù)方清熱顆粒由蒲公英、敗醬草、虎杖、半枝蓮組成，具有清熱解毒和瀉下等功效。多項(xiàng)研究表明復(fù)方清熱顆粒具有抗菌活性，可以改善耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等的耐藥性［4-5］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討復(fù)方清熱顆粒能否改善多重耐藥Ecl的耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 動物 健康大耳白兔12只，體質(zhì)量1.8～2.5 kg，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 菌株 實(shí)驗(yàn)組菌株為2009年至2013年北京友誼醫(yī)院微生物室菌庫保存的臨床分離多重耐藥Ecl菌株，均對青霉素類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗生素耐藥，共13株；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，EclATCC13047，為友誼醫(yī)院檢驗(yàn)中心微生物室保存菌株。

1.3 藥物 環(huán)丙沙星（CIP）：購自中國食品藥品檢定研究院，批號13045-201203，用無菌去離子水配成濃度為2.56 mg/mL的儲備母液，過濾除菌，于-20℃保存?zhèn)溆?；中藥?fù)方清熱顆粒劑（蒲公英、敗醬草、黃芪、半枝蓮等）：由北京康仁堂藥業(yè)有限公司按指定藥方比例加工合成。

1.4 試劑與設(shè)備 碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）：美國Sigma公司，C2759-100MG；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），北京索來寶科技有限公司，200-664-3；血瓊脂培養(yǎng)基，生物梅里埃（法國）公司；MH瓊脂粉，批號1136737，OXOID有限公司。VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)，生物梅里埃（法國）公司；光電比濁儀，生物梅里埃（法國）公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.5 血清制備 （1）復(fù)方清熱顆粒含藥血清的制備：隨機(jī)分為試驗(yàn)組與空白對照組各6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將復(fù)方清熱顆粒用無菌去離子水溶解，試驗(yàn)組每日予10倍臨床劑量復(fù)方清熱顆粒劑藥液 ［22 g/（kg·d）］灌胃，每日2次，連續(xù)5 d；第5日末次給藥后1 h，無菌心臟采血，4000 rpm×10 min離心，分離含藥血清后混合，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）空白血清的制備：選空白對照組6只健康大耳白兔，每天予滅菌蒸餾水［40 mL/（kg·d）］灌胃，每日2次，連續(xù)5 d；5 d后心臟采血，離心得空白血清，-20℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.6 外排泵表型陽性MDREcl的篩選 臨床分離的多重耐藥Ecl 13株，分別挑取單個(gè)菌落平板三區(qū)劃線于血瓊脂培養(yǎng)基中，35℃恒溫培育箱中培養(yǎng)18 h時(shí)，然后分別挑取單菌落，用無菌生理鹽水稀釋，比濁儀調(diào)節(jié)菌液濃度值至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋s108CFU/mL），再依次稀釋至104CFU/mL。同法配制EclATCC13047作為質(zhì)控。分別配制含不同濃度CIP和CIP+CCCP的MH瓊脂平板，抗生素和培養(yǎng)液按1∶9比例配制，CIP終濃度分別為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128，256 μg/mL，CCCP終濃度為2.56 μg/mL（該質(zhì)量濃度對細(xì)菌外排泵有較好抑制作用，且對細(xì)菌生長無影響［6］）。將13株MDR-Ecl分別接種于已配制好的含不同濃度CIP和含不同濃度CIP+CCCP的MH瓊脂平板中，細(xì)菌接種量為104CFU/mL，35℃恒溫培育箱中培養(yǎng)18 h，采用瓊脂對倍稀釋法測出各組CIP的MIC值，并設(shè)一空白對照組和只含2.56 μg/mL CCCP的陰性對照組。以含CCCP時(shí)CIP的MIC值較不含CCCP的MIC值降低≥4倍作為外排泵表型陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)［7］。共篩選出10株外排泵表型陽性的MDR-Ecl，分別為E1～5、E8、E10～13，P＝0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻灼矫蠹爸缓?.56 μg/mL CCCP的MH平板上細(xì)菌生長良好。具體MIC值見表1，圖1。

表1 應(yīng)用CCCP前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）變化（P＝0.01）

圖1 CIP和CIP+CCCP對MDR-Ecl MIC值（μg/mL）變化（P＝0.01）

1.7 外排泵表型陽性MDR-Ecl藥敏試驗(yàn) 分別測定空白血清、含藥血清、中藥復(fù)方清熱顆粒、中藥+CIP、空白血清+CIP、含藥血清+CIP及中藥+CIP+CCCP等不同藥物組成對外排泵陽性MDR-Ecl的MIC值變化，以Ecl ATCC13047為質(zhì)控菌株。結(jié)果按CLSI 2012版標(biāo)準(zhǔn)判讀［8］。（1）含藥血清及空白血清的MIC值測定：配制20 mL含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿，含藥血清及空白血清含量分別為0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL。分別接種上述外排泵表型陽性的多重耐藥Ecl菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為104CFU/mL，于35℃恒溫箱培育18 h。上述4個(gè)含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿上的Ecl菌菌株均生長良好，未測出含藥血清及空白血清的MIC值。（2）中藥復(fù)方清熱顆粒MIC值測定：用電子天平準(zhǔn)確稱取 2g復(fù)方清熱顆粒，先用少量DMSO（占總體積＜1％）溶解，加入10 mL無菌去離子水中，使之充分溶解，過濾除菌備用。配制含中藥復(fù)方清熱顆粒的MH瓊脂平皿，中藥終濃度分別為：0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分別接種上述外排泵表型陽性MDR-Ecl菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液約104CFU/mL，并于35℃恒溫箱培育18 h后測定CIP的MIC值。當(dāng)中藥原液濃度為20 mg/mL時(shí)，所有菌株均無生長；在中藥原液終濃度為0.625 mg/mL的MH培養(yǎng)平板中，可見各菌株均有生長。記錄不同濃度復(fù)方清熱顆粒MIC值見表2。（3）測定。

表2 復(fù)方清熱顆粒（mg/mL）對MDR-Ecl的MIC值

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用配對t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥+CIP組MIC值 見表3，圖2。結(jié)合（2）試驗(yàn)結(jié)果，制備含中藥復(fù)方清熱顆粒和CIP的MH瓊脂平皿，分為4組，每組CIP的質(zhì)量終濃度均分別包括：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，中藥終濃度分別為：0.625、1.25、2.5 mg/mL。接種各細(xì)菌菌懸液及質(zhì)控菌株懸液并于恒溫箱中培育，具體試驗(yàn)方法同上。CIP組和CIP+中藥0.625 mg/mL組、CIP組和CIP+中藥1.25 mg/mL組MIC值相當(dāng)（P＞0.05），CIP組和 CIP+中藥 2.5 mg/mL組 MIC值下降（P＜0.05）。

表3 復(fù)方清熱顆粒（mg/mL）作用下CIP的MIC值（μg/mL）

圖2 CIP和CIP+復(fù)方清熱顆粒（2.5 mg/mL）的MIC值變化（μg/mL）（P＝0.015）

2.2 空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值 見表4，圖3。分別配制含空白血清+CIP組和含藥血清+CIP組MH瓊脂平皿，空白血清體積為2 mL（1組），含藥血清體積分別為：0.5 mL、1 mL、2 mL（命名為2、3、4組），CIP終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。分別接種上述菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，細(xì)菌接種量及培育時(shí)間同上。CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）（P＞0.05）

圖3 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）（P＞0.05）

2.3 中藥復(fù)方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值 見表5，圖4。制備MH瓊脂平皿，每個(gè)MH瓊脂平皿中復(fù)方清熱顆粒的終濃度均為 2.5 mg/mL，CCCP的濃度為2.56 μg/mL，CIP質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。同樣試驗(yàn)方法進(jìn)行細(xì)菌接種及恒溫孵育。CIP+CCCP組與中藥+CIP+CCCP組MIC值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 復(fù)方清熱顆粒劑+CIP+CCCP組CIP的MIC值（μg/mL）（P＝0.031）

圖4 CIP+CCCP和CIP+CCCP+復(fù)方清熱顆粒2.5 mg/mL時(shí)CIP的MIC值（μg/mL）

3 討論

近年國內(nèi)外越來越多研究發(fā)現(xiàn)，Ecl細(xì)菌外膜上存在特殊的AcrAB-TolC主動外排泵系統(tǒng)，能將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物不斷排出，使菌體內(nèi)的藥物濃度降低從而導(dǎo)致耐藥。由于主動外排泵系統(tǒng)作用底物廣泛，故被認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性尤其是多重耐藥的重要原因。外排泵抑制劑（EPIs）可以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對抗生素的敏感性，成為改善細(xì)菌耐藥的途徑之一。但這些抑制劑目前大多仍處于試驗(yàn)階段，許多在體外活性良好的外排泵抑制劑由于安全性、特異性以及機(jī)制尚不明確等諸多原因而未應(yīng)用于臨床治療，因而研發(fā)新型外排泵抑制劑或其他途徑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的藥物成為趨勢［9］。

本文從中醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，探討中藥對細(xì)菌主動外排泵作用的影響。實(shí)驗(yàn)以多重耐藥Ecl為實(shí)驗(yàn)菌株，中藥復(fù)方清熱顆粒及其含藥血清為主要研究對象，主要觀察在分別聯(lián)合含藥血清、中藥復(fù)方清熱顆粒及CC-CP前后環(huán)丙沙星（CIP）的MIC值變化。通過分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：（1）空白血清組、含藥血清組為測得最小抑菌濃度，其分別聯(lián)合CIP后MIC值變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均說明含藥血清不能改善Ecl的耐藥性；（2）CIP＋中藥復(fù)方清熱顆粒組與單用CIP組比較，加入中藥復(fù)方制劑后CIP的MIC值明顯下降（P＜0.05），說明一定濃度復(fù)方清熱顆粒具有抑菌效果，且與西藥聯(lián)合后能明顯改善外排泵陽性多重耐藥Ecl對環(huán)丙沙星的耐藥情況。（3）中藥＋CIP＋CCCP組MIC值較CIP＋CCCP組MIC值顯著下降（P＜0.05），說明當(dāng)CCCP阻斷外排泵能量來源后，中藥原液仍可以通過其他作用機(jī)制改善環(huán)丙沙星耐藥情況，既往研究顯示復(fù)方清熱顆粒對耐藥細(xì)菌外膜通透性具有干預(yù)作用，使外膜蛋白含量增加從而降低細(xì)菌耐藥性［10］，可能與中藥干擾外膜通透性機(jī)制有關(guān)。

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Vitro Medicine Sensitive Experiments about Compound Qingre Granules on Efflux Pumps of Multidrug-resistant Enterobacter Cloacae

CHEN Yujiao，REN Aimin，WANG Hong，et al.Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Objective：To explore the effect of Compound Qingre Granules on efflux pumps of multidrug-resistant enterobacter cloacae.Methods：Ⅰ.The preparation of drug serum：healthy rabbits with big ears were selected and randomly divided into two groups：6 in experimental group and 6 in control group.After one week of adaptive feeding，experimental group was given Compound Qingre Granules by intragastric administration twice a day for 5 days.The control group was given sterile purified water in the same way with the same dose.Blood was drawn from heart after 60 minutes at the last medication and was centrifuged to separate drug serum and blank serum，which were then conserved in-20℃.Ⅱ.10 strains of efflux pump positive multidrug-resistant enterobacter cloacae were selected by using CCCP.The minimal inhibitory concentration of ciprofloxacin was measured within and withiout Compound Qingre Granules，drug serum，blank serum and CCCP by agar dilution method.Results：Compound Qingre Granules could significantly reduce the MIC of ciprofloxacin to multidrug-resistant enterobacter cloacae.Conclusions：Compound Qingre Granules can alleviate the resisitance of multidrug-resistant enterobacter cloacae.

Enterobacter cloacae；Efflux pump；Compound Qingre Granules

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1460-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.025

2014-05-19）

北京市中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科基金（京中醫(yī)科字【2012】250號）