通腑瀉肺方對膿毒癥急性肺損傷大鼠NLRP3調(diào)控作用的實驗研究*

張 濤 熊旭東 趙 敏

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

通腑瀉肺方對膿毒癥急性肺損傷大鼠NLRP3調(diào)控作用的實驗研究*

張 濤 熊旭東△趙 敏

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

目的觀察通腑瀉肺方對膿毒癥急性肺損傷大鼠NLRP3炎性體表達的影響，探索通腑瀉肺方治療膿毒癥急性肺損傷的作用機制。方法采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）復(fù)制膿毒癥急性肺損傷動物模型。將32只清潔級健康成年雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組8只?？瞻讓φ战M麻醉后腹主動脈采血致死；假手術(shù)組麻醉后開腹，翻動胃腸后關(guān)腹，24 h后麻醉并腹主動脈采血致死；模型組于CLP后立即予生理鹽水2 mL灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分別給予生理鹽水2 mL灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主動脈采血致死；治療組于CLP后立即予通腑瀉肺方中藥灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分別給予通腑瀉肺方中藥灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主動脈采血致死。觀察各組大鼠的一般表現(xiàn)，ELISA法檢測各組血清中Caspase-1含量，Western blot法檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC含量，RT-PCR法檢測肺組織中NLRP3、ASC的mRNA表達量。結(jié)果模型組和治療組肺組織NLRP3、ASC的蛋白水平、mRNA表達水平以及血清中caspase-1水平均顯著高于空白對照組和假手術(shù)組（P＜0.01）；模型組肺組織NLRP3、ASC的蛋白水平、mRNA表達水平以及血清中Caspase-1水平顯著高于治療組（P＜0.01）。結(jié)論通腑瀉肺方能夠下調(diào)膿毒癥急性肺損傷大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1的表達水平，具有調(diào)控NLRP3炎性體合成的作用。

膿毒癥 通腑瀉肺方 炎性體 急性肺損傷

膿毒癥是由感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），是燒創(chuàng)傷、休克等臨床危急重癥嚴重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要原因。膿毒癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其病死率也居高不下。防治膿毒癥措施的研究是目前臨床亟待解決的重要課題。本文作者之一熊旭東教授通過長期臨床觀察、總結(jié)近現(xiàn)代中醫(yī)各家對膿毒癥病因病機的認識，根據(jù)中醫(yī)藏象學說中“肺與大腸相表里”理論，提出以肺腸同治法治療肺炎膿毒癥和膿毒癥急性肺損傷，并自擬中藥通腑瀉肺方應(yīng)用于臨床，取得較好的療效。本實驗擬通過觀察通腑瀉肺方對膿毒癥急性肺損傷大鼠NLRP3炎性體、半胱天冬氨酸酶-1（Caspase-1）表達的影響，探索通腑瀉肺方治療膿毒癥急性肺損傷的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 清潔級8周齡健康成年雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量200～220 g，購自上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）造模。大鼠經(jīng)2％的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于腹正中線做一1.5 cm縱行切口，找到盲腸，在其根部用縫合線結(jié)扎，用18號針將盲腸穿通3次，并擠出少量腸內(nèi)容物，留置2 mm皮瓣防止針孔閉合，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢予皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）抗休克。

1.2 器材與試劑 大鼠Caspase-1定量酶聯(lián)檢測試劑盒，購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；總RNA提取試劑盒Ⅱ，由廣州捷倍斯生物科技有限公司生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄采用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒。PCR反應(yīng)采用康為世紀的UltraSYBR Mixture試劑盒。

1.3 通腑瀉肺方的制備 通腑瀉肺方藥物組成：生大黃3 g，葶藶子15 g，川芎9 g，黃芩15 g。加10倍體積的蒸餾水將飲片浸泡30 min后大火煮沸，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min，起鍋前10 min加入大黃，第2煎加6倍體積的蒸餾水煎煮，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min。2次煎液混合，用4層無菌紗布過濾，藥液濃縮成含生藥1.0 g/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物分組及干預(yù)措施 清潔級8周齡健康成年雄性SD大鼠32只，隨機分為4組：空白對照組8只，假手術(shù)組8只，模型組8只，治療組8只。空白對照組不做任何處理，24 h后麻醉并腹主動脈采血致死。假手術(shù)組麻醉后開腹，翻動胃腸后關(guān)腹，24 h后麻醉并腹主動脈采血致死。模型組于CLP后立即予生理鹽水2 mL灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分別給予生理鹽水2 mL灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主動脈采血致死。治療組于CLP后立即予通腑瀉肺方中藥（10 g/kg）灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分別給予通腑瀉肺方中藥（10 g/kg）灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主動脈采血致死。

1.5 標本采集 2％戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，拉開腸等腹腔內(nèi)器官，打開后腹膜，暴露腹主動脈，以10 mL無菌注射器緩慢抽血，分裝在非抗凝無菌試管中，靜置30 min，以3000 r/min離心15 min，取上層血清200 μL，分裝入EP管中，-20℃冰箱保持待用。大鼠采血后取肺組織標本用錫紙包好后置入液氮罐中保存待用。

1.6 檢測指標及方法 觀察術(shù)后24 h內(nèi)大鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、食欲、活動情況、外觀形態(tài)、毛色、糞便、分泌物等。ELISA法檢測大鼠血清Caspase-1含量；Western-Blot法檢測肺組織NLRP3、ASC蛋白含量；熒光定量PCR法檢測肺組織NLRP3、ASC的mRNA表達水平。NLRP3引物序列如下。上游：5′-GCTA AGAAGGACCAGCCAGA-3′。下游：5′-CCAGCAAACC TATCCACTCC-3′。擴增長度：100bp。ASC引物序列如下。上游：5′-TTGCTGGATGCTCTGTATGG-3′。下游：5′-CCAAGTAGGGCTGTGTTTGC-3′。擴增長度：172 bp。GAPDH引物序列如下。上游：5′-ACCACAGTCCATGC CAT-CAC-3′。下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。擴增長度：452 bp。

1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布，計量資料以（±s）表示，正態(tài)性檢驗的檢驗水準α＝0.10，方差分析的檢驗水準α＝0.05。兩組之間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般狀況比較 空白對照組和假手術(shù)組大鼠外觀形態(tài)、飲食、活動等情況正常。模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)精神萎靡，活動明顯減少，呼吸頻率明顯加快，飲食明顯減少，腹部出現(xiàn)膨隆，眼角出現(xiàn)分泌物，排泄物增多等狀況。治療組大鼠上述癥狀較模型組為輕，精神狀態(tài)、活動情況明顯好于模型組，腹部膨隆、分泌物、排泄等情況也優(yōu)于模型組。

表1 各組大鼠血清Caspase-1水平的比較（±s）

表1 各組大鼠血清Caspase-1水平的比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 n Caspase-1空白對照組 8假手術(shù)組 8模型組 8 13.30±2.68 12.56±3.60 49.16±6.70*#治療組 826.46±1.88*#△

2.2 各組大鼠血清Caspase-1水平的比較 見表1。模型組和治療組的Caspase-1水平顯著高于空白對照組和假手術(shù)組，模型組Caspase-1水平顯著高于治療組（P＜0.05或P＜0.01），空白對照組和假手術(shù)組水平相當（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC蛋白水平的比較見表2。模型組和治療組的NLRP3、ASC蛋白水平顯著高于空白對照組和假手術(shù)組，模型組NLRP3、ASC蛋白水平顯著高于治療組（P＜0.05或P＜0.01），空白對照組和假手術(shù)組水平相當（P＞0.05）。

表2 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC蛋白水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC蛋白水平比較（±s）

組 別 n NLRP3/GAPDH ASC/GAPDH空白對照組 8 0.44±0.01 0.40±0.04假手術(shù)組 8 0.48±0.03 0.42±0.02模型組 8 1.47±0.06*# 1.17±0.05*#治療組 8 0.90±0.05*#△ 0.78±0.03*#△

2.4 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC的mRNA表達水平的比較 見表3。模型組和治療組的NLRP3、ASC的mRNA表達水平顯著高于空白對照組和假手術(shù)組，模型組NLRP3、ASC的mRNA表達水平顯著高于治療組（P＜0.05或P＜0.01），空白對照組和假手術(shù)組水平相當（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC的mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC的mRNA表達水平比較（±s）

組 別 n NLRP3 mRNA相對表達量 ASC mRNA相對表達量空白對照組 8 1.49±0.31 0.17±0.03假手術(shù)組 8 1.74±0.16 0.20±0.06模型組 8 117.17±6.64*# 1.78±0.10*#治療組 8 72.67±4.30*#△ 0.98±0.06*#△

3 討論

通腑瀉肺方以生大黃為君，以其苦寒之性，通腑瀉熱，釜底抽薪。葶藶子苦降辛散，性寒清熱，瀉肺中水飲及痰火而平喘；黃芩上行瀉肺火，下行瀉膀胱之火，清熱解毒、宣肺化痰；兩藥共為臣藥。佐以川芎有行氣活血，調(diào)暢氣機之功效。之前的研究顯示通腑瀉肺方可以降低AECOPD患者白介素8（IL-8）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平［1］，本實驗則從炎性體的角度，探討通腑瀉肺方對膿毒癥急性肺損傷的作用機制。

炎性體（inflammasome）是存在于細胞胞漿內(nèi)的一類由活化的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLRs）誘導(dǎo)裝配而成的大分子、多蛋白復(fù)合物［2］，具有介導(dǎo)機體固有免疫反應(yīng)的重要作用。NLRP3炎性體是炎性體家族中的一員，其結(jié)構(gòu)是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬氨酸酶-1前體（pro-caspase-1）裝配組成的。NLRP3通過識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或危險相關(guān)分子模式（DAMPs），與配體結(jié)合而被激活，誘導(dǎo)NLRP3炎性體組裝，并促使其發(fā)生寡聚化，寡聚化的pro-caspase-1則發(fā)生自身酶解，形成具有生物活性的caspase-1，caspase-1促使白介素-1β前體（pro-IL-1β）和白介素-18前體（pro-IL-18）成熟，生成具有生物活性的IL-1β和IL-18，并分泌到細胞外，從而發(fā)揮其生物效應(yīng)。NLRP3炎性體可以被廣泛的外源性和內(nèi)源性的刺激物所激活。微生物感染，如仙臺病毒、流感病毒、腺病毒、釀酒酵母菌和白色念珠菌，以及一些細菌如金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌，福氏志賀菌等［3-5］均可以誘導(dǎo)NLRP3炎性體的激活。在某些情況下，一些特定的微生物成分也可以觸發(fā)NLRP3炎性體的激活，如細菌RNA，瘧原蟲色素結(jié)晶［6-7］和許多細菌成孔毒素，如尼日利亞菌素、刺尾魚毒素、氣單胞菌溶素和李斯特菌溶胞素［5］等。

炎性體作為固有免疫應(yīng)答過程中的重要物質(zhì)，與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系。炎性體主要通過激活caspase-1從而起到抗感染、清除病原微生物的重要作用。有研究顯示，將小鼠的caspase-1基因敲除后，其對包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、土拉熱桿菌、福氏志賀菌等在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)出明顯的易感性，抵御李斯特假單胞菌和白色念珠菌的能力也明顯降低［8］。與野生型雜合子小鼠相比，caspase-1基因敲除小鼠的抗感染能力明顯下降，在膿毒癥中的死亡率明顯升高［9］。

在本實驗中模型組和治療組的NLRP3、ASC蛋白水平和mRNA表達水平均顯著高于空白對照組和假手術(shù)組，說明NLRP3炎性體水平在膿毒癥發(fā)病時出現(xiàn)明顯升高，提示其在膿毒癥的病理機制中具有重要作用。治療組的NLRP3、ASC蛋白水平和mRNA表達水平也明顯較模型組低，說明通腑瀉肺方能夠使NLRP3、ASC的表達下調(diào)，從而調(diào)控NLRP3炎性體的合成。模型組和治療組的caspase-1水平顯著高于空白對照組和假手術(shù)組，而治療組caspase-1水平顯著低于模型組。這一結(jié)果說明通腑瀉肺方具有下調(diào)Caspase-1水平的作用，這與其對NLRP3、ASC的調(diào)控作用是相一致的。同時，本實驗結(jié)果也提示通過調(diào)控炎性體而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的程度可能成為膿毒癥治療的靶點。

［1］陳莉云，熊旭東，李淑芳.通腑瀉肺方對AECOPD痰熱壅肺證的療效分析及對炎癥介質(zhì)的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2013，22（9）：1512-1514.

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Experimental Study of Tongfuxiefei Decoction on Regulating NLRP3 in Rats with Sepsis in Acute Lung Injury

ZHANG Tao，XIONG Xudong，ZHAO Min. Shu Guang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200021，China

Objectives：To observe the effect of Tongfuxiefei decoction on expression of inflammasome NLRP3 in rats with sepsis in acute lung injury（ALI）and to explore the mechanism of Tongfuxiefei decoction in sepsis treatment.Methods：The animal model of sepsis in acute lung injury was made by cecal ligation and puncture（CLP）. 32 male SD rats were randomly divided into four groups：control group，sham operation group，model group and treatment group.Each group has 8 rats.The control group rats were sacrificed by extracting the blood from abdominal aorta after anesthesia.The sham operation group rats were opened the abdomen and turned over intestinal tract after anesthesia，then closed the abdomen，got the blood 24 h later after anesthesia.The model group rats were given 2ml normal saline and the treatment group rats were given Tongfuxiefei decoction by intragastric administration 6 h and 12 h after CLP.Rats in both groups were sacrificed by extracting the blood from abdominal aorta at 24h later after CLP.Observe the general performance of each group.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the level of Caspase-1 in serum.The protein and the mRNA expressions of NLRP3 and ASC in lung tissue were respectively detected by Western blot method and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：The protein levels and mRNA expressions of NLRP3 and ASC，and Caspase-1 levels of the model group and of the treatment group were significantly higher than those of the control group and of the sham operation group（P＜0.01）.The protein levels and mRNA expressions of NLRP3 and ASC，and Caspase-1 levels of model group were significantly higher than those of treatment group（P＜0.01）.Conclusions：Tongfuxiefei decoction can reduce the expression of NLRP3 and ASC as well as the level of Caspase-1，so as to regulate NLRP3 synthesis.

Sepsis；Tongfuxiefei decoction；Inflammasome；Acute lung injury

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1406-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.004

2014-05-11）

高等學校博士學科點專項科研基金（20113107110003）

△通信作者