舒郁散對慢性應激抑郁大鼠行為及海馬糖皮質(zhì)激素受體表達的影響*

陳利平 王發(fā)渭 段冬梅 孫志高 許成勇

（解放軍總醫(yī)院海南分院中醫(yī)科，海南 三亞 572004）

·研究報告·

舒郁散對慢性應激抑郁大鼠行為及海馬糖皮質(zhì)激素受體表達的影響*

陳利平 王發(fā)渭 段冬梅 孫志高 許成勇

（解放軍總醫(yī)院海南分院中醫(yī)科，海南 三亞 572004）

目的觀察舒郁散對慢性不可預見性應激（CUMS）抑郁大鼠的行為變化及對大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量、海馬內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體表達的影響。方法50只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、百憂解組、舒郁散小劑量組、舒郁散大劑量組。對大鼠進行21 d的CUMS刺激，采用糖水實驗、懸尾實驗觀察大鼠的行為改變，用ELISA法測大鼠腦組織TNF-α含量，免疫組化觀察大鼠海馬GR表達。結(jié)果百憂解組、舒郁散大劑量組大鼠的尾懸不動時間明顯延長、糖水消耗百分率明顯下降，與模型組比差異顯著（P＜ 0.01）。百憂解、舒郁散大劑量治療組大鼠懸尾不動時間明顯減少，糖水消耗量明顯增加，與模型組比差異顯著（P＜0.05）。百憂解、舒郁散大劑量治療組大鼠腦組織TNF-α含量顯著降低，與模型組比差異顯著（P＜ 0.05）。模型組海馬GR免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，百憂解組、舒郁散大劑量組海馬GR免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，平均光密度明顯增強，與模型組比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論動物行為學顯示舒郁散具有抗抑郁作用，這種作用與降低CUMS抑郁大鼠腦組織TNF-α含量，增強海馬糖皮質(zhì)激素受體表達有關，上述作用與其劑量呈正相關。

舒郁散抑郁大鼠動物行為糖皮質(zhì)激素受體海馬腫瘤壞死因子-α

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，研究表明與心理、神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、激素水平的變化有關［1］。機體長期處于應激狀態(tài)時，會出現(xiàn)神經(jīng)、內(nèi)分泌的功能改變，主要變化為下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的功能亢進，出現(xiàn)大腦海馬區(qū)激素受體的表達過度引起海馬神經(jīng)元的損傷及其功能障礙［2］，患者出現(xiàn)情緒低落、抑郁、失眠、健忘等癥狀［3］。舒郁散是本院臨床應用多年治療抑郁癥的有效驗方，具有疏肝解郁、養(yǎng)心安神之功效，可改善抑郁患者的臨床癥狀；可調(diào)節(jié)慢性應激抑郁大鼠血清激素水平、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽以及海馬5-HT受體表達而發(fā)揮抗抑郁的作用［4-5］。本研究采用慢性不可預見的應激（CUMS）抑郁模型，觀察舒郁散對模型大鼠行為、海馬腎上腺皮質(zhì)激素受體表達的影響，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物及分組50只Wistar大鼠，解放軍總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心提供，動物號為SCXK-京-2011-0005，體質(zhì)量180～220g。隨機分為正常對照組、模型組、百憂解組（20mg/次）、舒郁散小劑量組（含生藥0.5 g/mL）、舒郁散大劑量組（含生藥5.0 g/mL），每組10只大鼠。正常對照組每籠飼養(yǎng)5只，其他組每籠飼養(yǎng)1只。

1.2 試物與儀器舒郁散由棗仁、郁金、梔子、五味子、炙麻黃組成，濃縮成含生藥量5 g/mL藥液，存冰箱備用，使用時蒸餾水稀釋灌胃；百憂解膠囊，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批準文號：國藥準字2006017。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）放免試劑盒由解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所生產(chǎn)；GR多克隆抗體（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號：SP-9000），二抗試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技（上海）有限公司產(chǎn)品（Code No.GK500705）。全自動真空脫水機（LEICAASP300）、組織包埋機（LEICA EG1140H）、石蠟切片機（LEICA RM2135）、展片機（LEICA HI1210，德國LEICA公司）；光學顯微鏡（日本OLYMPUSBX60系統(tǒng)顯微鏡），酶標儀THERMOMultiskanMK3（美國產(chǎn)品）。

1.3 模型制備對大鼠進行21 d應激刺激，包括：搖晃5min，禁水24 h、禁食24 h、夾尾1min，電擊足底（每次10 s，間隔1min），冰水游泳5min，噪音刺激、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律24 h，制動，熱刺激40℃5min。連續(xù)造模和給藥21 d，每日上午給藥，下午給予相應刺激［6］，以制備CUMS抑郁模型。

1.4 動物行為學檢測

1.4.1 懸尾實驗（TST）將大鼠尾端4 cm的部位固定在一根水平木棍上，使之呈倒掛狀態(tài)，其頭部離水平面5～6 cm，用木板隔開相鄰大鼠的視線，記錄每只動物在5min內(nèi)不動時間；實驗后用酒精清除箱內(nèi)上一只大鼠留下的殘留物和氣味，防止對其他大鼠行為產(chǎn)生影響。

1.4.2 糖水消耗實驗（SPT）實驗前給大鼠正常的水和食物供應，實驗開始時移去所有食物和水，將大鼠單獨成籠，每個籠子中央緊靠著放體積相同的1％蔗糖水和自來水各1杯，在5 h內(nèi)讓其自由攝水。為了防止大鼠對某側(cè)的蔗糖水或自來水形成特殊的偏好，5 h后，交換蔗糖水和自來水的位置。再經(jīng)過5 h后，測量大鼠攝入蔗糖水和自來水的量，計算出攝入蔗糖水的百分比=蔗糖水量/（蔗糖水量+自來水量）×100％。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 腦組織TNF-α含量測定行為實驗結(jié)束后處死大鼠，斷頭取腦，分離大腦皮層，生理鹽水沖洗，稱質(zhì)量，制備成10％組織勻漿，-70℃冰箱中保存測腦組織TNF-α含量。

1.5.2 海馬GR免疫組化檢測參照大鼠腦定位圖譜［7］，取海馬進行脫水、包埋，置于APES防脫玻片上。烤片、脫蠟、脫水、浸洗；3％H2O210min，PBS浸洗2min，共3次；浸入0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液。微波熱修復后，滴加一抗NPY多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱孵育過夜，室溫復溫30min后PBS浸洗5min，共3次后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30min，PBS浸洗5min，共3次，DAB顯色光鏡下控制時間，脫水、透明、封片。采用Image Pro plus5.1圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞灰度進行圖像分析，取平均值行統(tǒng)計學處理。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組TST、SPT的比較見表1。結(jié)果顯示模型大鼠懸尾實驗中不動時間明顯增多，糖水消耗百分率明顯下降，與正常對照組比差異顯著（P＜0.01），說明造模成功。百憂解組、舒郁散大劑量組大鼠懸尾不動時間明顯減少，糖水消耗百分率顯著升高，與模型組比差異顯著（P＜0.05）。

表1 各組TST、SPT結(jié)果比較（分，±s）

表1 各組TST、SPT結(jié)果比較（分，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n懸尾不動時間（s）糖水消耗百分比（％）正常對照組10 56.00±5.24 86.42±11.25模型組10 84.40±7.74*51.43±8.76*百憂解組10 66.72±6.23△77.24±10.26△舒郁散大劑量組10 68.24±6.46△75.36±9.74△舒郁散小劑量組10 78.46±7.25 67.25±9.14

2.2 治療后各組大鼠腦組織TNF-α含量、海馬GR表達見表2。結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織TNF-α含量明顯升高，與對照組比差異顯著（P＜0.05）；大劑量舒郁散、百憂解治療后腦組織TNF-α含量顯著降低，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。光鏡下可見GR免疫反應陽性細胞的胞核呈棕黃色，多位于細胞核內(nèi)，胞漿免疫染色淺。模型組大鼠海馬區(qū)GR陽性細胞數(shù)目減少，表達減低，平均光密度值明顯減弱與正常對照組比差異顯著（P＜0.05）；百憂解及舒郁散大劑量治療后大鼠海馬區(qū)GR表達明顯增加，平均光密度明顯增多，與模型組比差異顯著（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織TNF-α含量、海馬GR表達比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織TNF-α含量、海馬GR表達比較（±s）

組別n正常對照組10模型組10百憂解組10舒郁散大劑量組10舒郁散小劑量組10腦組織TNF-α（pg/mL）海馬GR積分平均光密度值20.46±1.85 0.134±0.013 38.42±5.76*0.376±0.034* 23.84±4.63△0.245±0.026*△24.15±4.72△0.253±0.028*△29.67±5.14 0.298±0.032

3 討論

HPA軸是抑郁癥的主要作用激素系統(tǒng)，50％以上的抑郁癥患者存在HPA軸的功能紊亂，抑郁癥患者存在與應激密切相關的HPA軸過度激活現(xiàn)象，表現(xiàn)為血漿皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的增高［8］。海馬還具有調(diào)節(jié)情緒、記憶、學習等功能，是慢性應激反應的主要受影響中樞和調(diào)節(jié)中樞。海馬中皮質(zhì)醇受體的含量最高，因此海馬主要涉及HPA軸的負反饋機制，通過GR抑制應激過程中亢進的HPA軸的功能。長期的慢性應激會導致HPA軸的功能亢進，機體分泌的皮質(zhì)醇增多，過量的皮質(zhì)醇及應激可引起神經(jīng)元處于易損狀態(tài)，出現(xiàn)海馬神經(jīng)元的凋亡，易于發(fā)生應激損傷性疾病如抑郁癥等。在動物實驗中，長期用抗抑郁藥能提高大鼠腦中的GR和鹽皮質(zhì)激素受體的水平，降低應激反應介導的糖皮質(zhì)激素過多的分泌［9］。

本研究通過采用CUMS抑郁模型［10］，不僅可模擬抑郁癥的核心癥狀，即興趣喪失，快感缺乏，運動能力、探索行為能力及性行為能力等下降，同時存在HPA軸的亢奮?，F(xiàn)在大部分學者采取糖水消耗量和糖水偏愛百分比作為測量快感缺乏的有效指標［11］。本研究顯示：CUMS抑郁癥大鼠糖水消耗量明顯下降，而大劑量舒郁散治療組其糖水消耗量明顯增加，提示給藥組大鼠對幸福事件反應能力的增加。尾懸不動時間是大鼠絕望的反應，大劑量舒郁散能明顯減少CUMS抑郁癥大鼠尾懸不動時間，說明舒郁散具有抗抑郁的作用。舒郁散可以降低CUMS抑郁大鼠腦組織TNF-α含量，減輕應激引起的炎癥發(fā)生。在大腦中，皮質(zhì)醇通過與受體結(jié)合來影響各種神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、及其他的受體的合成和功能，以調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元的功能［12］，舒郁散能增強海馬糖皮質(zhì)激素受體表達，減少過量皮質(zhì)醇的產(chǎn)生，減輕應激反應引起海馬神經(jīng)元調(diào)亡，保護海馬神經(jīng)元。

抑郁癥類似于中醫(yī)的“郁證”，其發(fā)病大多是由情志所傷，肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，氣機不和所致，病變部位初期在肝，隨著肝郁氣滯、氣機失和，日久則傷及心、脾二臟，或為心火，或肝郁犯脾。因此，治療抑郁癥，實證以疏肝理氣解郁為主，虛證宜養(yǎng)心健脾安神。舒郁散具有調(diào)理心肝、疏肝理氣、養(yǎng)心解郁之功效，對抑郁癥的治療具有較好療效，對慢CUMS抑郁血清的腎上腺皮質(zhì)激素水平具有調(diào)節(jié)作用［13-14］。本實驗結(jié)果顯示大劑量舒郁散能明顯增加CUMS大鼠糖水消耗量、減少CUMS大鼠尾懸不動時間，具這種作用與降低CUMS大鼠腦組織TNF-α含量，增強海馬糖皮質(zhì)激素受體表達有關，這可能是其抗抑郁的作用機制之一。

本研究僅觀察舒郁散對CUMS抑郁大鼠行為、腦組織TNF-α含量，海馬糖皮質(zhì)激素受體表達的變化，抑郁癥的發(fā)病機理較為復雜，有關舒郁散的作用機理還有待與進一步的研究。

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Effect of Suyusan on the Behavior and Glucocorticoid Receptor Expression in Hippocampuswith Chronic Unpredictable Mild Stress induced Depression Rats

CHEN Li-ping，WANG Fa-wei，DUAN Dong-mei，et al.

Hainan branch of PLA General Hospital，Hainan，Sanya 572004，China

Objective：To investigate the effect of Suyusan on the behavior，the contents of tumor necrosis facor-α（TNF-α）in cortexand glucocorticoid receptor expression in hippocampuswith chronicmild unpredictable tressmodel of rats（CUMS）.Methods：50 Sprague-Dawley ratswere random ly divided into 5 groups：Normalcontrol group，CUMSmodel group，CUMS group plus fluoxetine treatment group，and CUMS group plus high/low dose Suyusan treatment group.Except normal group，the other groups were given the chronic mild unpredicted timulated for 21 days.Aftermodeling，the behavior of the rats was detected by Tail suspend test（TST）and sucrose preference test（SPT）.The contentof TNF-αin cortex was determined by enzyme linked immunosorbentasay（ELISA）.The immunocytochemical technique was used to evaluate hippocampus GR immunoreactive express.Results：The fluoxetinetreatmentgroupand highdose of Suyusan group showed significant increase in the sucrose consumption and decrease in the immobility time in TST，there was a significant difference compare with CMUS-model group.The TNF-αlevel was significantly lower in fluoxetine group and high dose of Suyusan group，there was significant difference compare withmodel group（P＜0.05）.The GR immunoreactive neurons in hippocampus areawas increased by amarked number in fluoxetinegroup and Suyusan high dose group，the average optical denity increased significantly，compared with themodel group，there were significant differences（P＜0.05）.Concluion：Suyusan has anti-depressionlikely effect.this effect connected with decrease TNF-αlevels in cortex of cerebraland increase expression of GR in hippocampuswith CMUS rats.

Suyusan；Depression；Rats；Behavior；Glucocorticoid receptor；Hippocampus；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0014-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.007

軍隊“十二五”科研攻關項目（CWS12J129）

2013-09-25）

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