融合蛋白CBD-SPA“Z”基因的構(gòu)建、表達(dá)與活性鑒定

朱文杰，馬 軍，張 妍，金 堅(jiān)

(1.江南大學(xué) 藥學(xué)院 無錫 214122;2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

各種微生物來源的纖維素酶普遍具有類似的 結(jié)構(gòu)，其中包括沒有催化功能的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain，CBD)［1］，其功能在與生物工程技術(shù)相關(guān)的研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用［2］。金黃色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)中含有E、D、A、B和C 5個(gè)高度同源的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，都能獨(dú)立地與IgG的Fc片段結(jié)合，其中B結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性最好，與IgG的結(jié)合能力最強(qiáng)［3－5］。由于只結(jié)合 Fc段，所以不會(huì)影響抗體的免疫學(xué)活性［6］，這使得利用 SPA親和層析柱純化IgG成為可能。為了提高 SPA及純化蛋白的穩(wěn)定性，基于B結(jié)構(gòu)域的優(yōu)勢，研究者們對其進(jìn)行改造，使結(jié)構(gòu)域中螺旋之間的角度產(chǎn)生改變［7］，降低其與IgG的結(jié)合強(qiáng)度，使洗脫條件變得溫和，最終將其命名為Z結(jié)構(gòu)域［8］。

長期以來，木質(zhì)生物質(zhì)被公認(rèn)為是1種潛在的具有可持續(xù)來源的生物多糖材料，在過去近1個(gè)世紀(jì)研究中，目標(biāo)明確的是如何在現(xiàn)今的市場中發(fā)揮其成本競爭力［9］。纖維素作為自然界中分布最廣、含量最多的1種多糖，應(yīng)用成本低廉。而隨著研究重心轉(zhuǎn)移的需求，若能把其與CBD之間的關(guān)系與應(yīng)用廣泛的抗體純化分子SPA有機(jī)結(jié)合，則不僅能為研究開發(fā)提供所需材料，同時(shí)在生物工程工業(yè)生產(chǎn)中還能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益［10］。

由于SPA能與IgG的Fc端特異性結(jié)合，一直以來都被廣泛應(yīng)用于抗體純化工作中，現(xiàn)在應(yīng)用較為廣泛的是把SPA連接到經(jīng)HBr活化的葡聚糖凝膠而制成的層析柱。由于SPA被包裹在基質(zhì)里，活性部位的分布具有不確定性，使得在純化過程中與抗體結(jié)合具有隨機(jī)性，導(dǎo)致SPA的使用效率低。另外葡聚糖等傳統(tǒng)基質(zhì)的抗壓性能相對較差［11］，使得上樣流速不能過快，導(dǎo)致純化時(shí)間較長，影響工作效率。此外HBr有劇毒［12］，處理不當(dāng)將會(huì)嚴(yán)重影響純化產(chǎn)品的質(zhì)量。針對上述問題，筆者把SPA改造后的Z基因和CBD基因進(jìn)行融合，構(gòu)建了一種新型表達(dá)載體。

有研究者做過將SPA的5個(gè)結(jié)構(gòu)域與CBD或其他活性結(jié)構(gòu)進(jìn)行融合的工作［13－14］，也有將 SPA改造后的Z結(jié)構(gòu)域與其他活性結(jié)構(gòu)進(jìn)行融合的成果［15］，但沒有發(fā)現(xiàn)把CBD與Z結(jié)構(gòu)域融合的相關(guān)研究。筆者嘗試將單個(gè)Z結(jié)構(gòu)域與CBD進(jìn)行融合，并在末端新添了1個(gè)半胱氨酸(Cys)，建立1種新型SPA改良層析材料，以期為在親和層析方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

帶有CBD基因的質(zhì)粒pET35b(+)和帶有Z基因的質(zhì)粒pEZZ18由藥學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與分子藥理研究室保存;E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司;1 kb plus DNA Ladder和DL2000 DNA Ladder購自Fermentas公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白Ladder和預(yù)染蛋白Ladder購自Thermo公司;限制性核酸內(nèi)切酶SacⅡ購自Fermentas公司，限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ購自Thermo公司;實(shí)驗(yàn)所用引物由Sangon公司合成;Taq Plus DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶、硫酸卡那霉素、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Sangon公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Beyotime公司;微晶纖維素(Type 50)購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 重組表達(dá)載體pET35b(+)-Z-Cys的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)質(zhì)粒pEZZ18上Z基因片段的編碼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列，引物如下。上游引物UZ:5'-TCCCCGCGGCGGTAGACAACAAATTCAAC-3'，下游引物 DZ:5'-CCCTCGAGACATTTCGGCGCCTGAGCATC-3'。根據(jù)質(zhì)粒pET35b(+)的多克隆位點(diǎn)，在上游引物中引入SacⅡ酶切位點(diǎn)，為保證開放閱讀框(ORF)不變，在SacⅡ酶切位點(diǎn)后添加2個(gè)堿基CG;在下游引物中引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，并在XhoⅠ酶切位點(diǎn)后引入Cys反密碼子ACA。

根據(jù)質(zhì)粒pET35b(+)上CBD基因片段的編碼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列，引物如下。上游引物UC:5'-CATGCCATGGGCATGTCAGTTGAATTTTACAACTCTAAC-3'，下游引物DC:5'-GGAATTCCATATGTGGTGCTGTACCAAGAACTTT-3'。

1.2.2 PCR擴(kuò)增Z序列

將合成的引物用超純水稀釋成終濃度為10 mmol/L，進(jìn)行溫度梯度PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇確定最佳退火溫度。質(zhì)粒pEZZ18 6 μL，引物 UZ 和 DZ 各加入 12 μL，10 ×PCR 緩沖溶液(含 MgCl220 mmol/L)30 μL，dNTPs(25 mmol/L)6 μL，Taq plus DNA 聚合酶(5 U/μL)6 μL，加超純水補(bǔ)足300 μL，分6管進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，結(jié)束前72℃延伸5 min。

1.2.3 目的片段的連接

合并擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由于質(zhì)粒pEZZ18中有連續(xù)的2段Z序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果會(huì)產(chǎn)生Z和ZZ大小2條條帶，用DNA膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物中的Z條帶;分別用SacⅡ和XhoⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pET35b(+)，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物;將回收的片段和載體用T4DNA連接酶于16℃連接過夜。

構(gòu)建的重組表達(dá)載體命名為pET35b(+)-ZCys，其質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 重組pET35b(+)-Z-Cys質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of expression vector pET35b(+)-Z-Cys

1.2.4 轉(zhuǎn)化與篩選

取100 μL E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化，加入連接液，輕輕吹打混勻，繼續(xù)冰浴30 min，將菌液放入42℃水浴中熱激90 s，立即放入冰浴中2 min，加入900 μL LB 培養(yǎng)基(提前預(yù)熱至37℃)，于37℃恒溫?fù)u床上溫育1 h，將菌液離心，留200 μL上清將菌體打散，均勻涂布于含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養(yǎng)過夜。用菌液PCR篩選陽性菌落，將鑒定呈陽性的菌液用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，利用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證篩選，排除假陽性菌落后，將鑒定呈陽性的對應(yīng)菌液送至Sangon公司測序，并將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET35b(+)-Z-Cys。

1.3 重組質(zhì)粒pET35b(+)-Z-Cys的表達(dá)

將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板表面。挑取單菌落接種于含有硫酸卡那霉素(0.1 mg/mL)的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例取過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有硫酸卡那霉素(0.1 mg/mL)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)至OD值為0.6～1.0，分別加入濃度為 0、0.6、0.8、1.0、1.2 和 1.4 mmol/L的IPTG，于37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。離心收集菌體，以10 mL/g(濕質(zhì)量)加入破碎緩沖液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.3)重懸，在冰水混合液中進(jìn)行超聲破碎(400 W，破碎6 s，停10 s)，離心取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.4 重組蛋白的活性鑒定

重組菌于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD值為0.6～1.0后，加入一定濃度的IPTG，在37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。離心收集菌體，以10 mL/g(濕質(zhì)量)加入破碎緩沖液進(jìn)行重懸，在冰水混合液中進(jìn)行超聲破碎，離心取上清液。

1.4.1 重組蛋白與IgG結(jié)合活性的鑒定

取蛋白上清液稀釋至一定倍數(shù)，進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析，進(jìn)而將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用濃度為5% 的蛋白液封閉后，用1 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為示蹤抗體孵育 2 h，用 TBST(0.01 mmol/L Tris、0.15 mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)0.05% 吐溫20，pH 7.5)洗滌后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為顯色底物進(jìn)行顯色，觀察結(jié)果。

1.4.2 重組蛋白與纖維素結(jié)合活性的鑒定

用磷酸緩沖液(PBS)(10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、150 mmol/L NaCl 、3 mmol/L KCl，pH 7.4)作為平衡液，利用恒流泵以流速2 mL/min進(jìn)行校準(zhǔn)洗滌微晶纖維素層析柱。待電腦核酸蛋白檢測儀的280 nm的吸光度值穩(wěn)定以后，破碎菌體上清液以流速2 mL/min上樣，待流穿峰過后，用PBS洗滌層析柱至吸光度值穩(wěn)定。利用50 mmol/L Tris/NaOH(pH 12.5)進(jìn)行洗脫，收集吸光度值最大峰值處的蛋白洗脫液。把收集的洗脫液和原上清液、流穿液稀釋到一定濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因片段的獲得及陽性克隆的鑒定

以質(zhì)粒 pEZZ18為模板，UZ/DZ為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的Z基因片段，預(yù)計(jì)有2條長度分別為351和177 bp的DNA條帶(圖2)。在瓊脂糖凝膠電泳泳道1中，在100～500 bp間有2條明顯的條帶(圖2(a))。該結(jié)果與預(yù)期的相符，說明質(zhì)粒pEZZ18中帶有Z基因片段。以質(zhì)粒pET35b(+)為模板，UC/DC為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的CBD基因片段，DNA長度應(yīng)為471 bp。在瓊脂糖凝膠電泳泳道2中，在500 bp附近有1條明顯的條帶(圖2(a))，該結(jié)果與預(yù)期的相符，說明質(zhì)粒pET35b(+)中帶有CBD基因片段。

把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET35b(+)-Z-Cys在16℃下進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖2(b)。由圖2(b)可知，在100～250 bp間有1條明顯的條帶，說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒中成功連接入了Z基因片段。以重組質(zhì)粒pET35b(+)-Z-Cys為模板，UC/DZ為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的pCBD-Z基因片段，其DNA長度應(yīng)為690 bp。結(jié)果如瓊脂糖凝膠電泳泳道2所示，在500～750 bp間有1條明顯的條帶(圖2(b))。結(jié)果與預(yù)期的相符，說明成功構(gòu)建了含有pCBD-Z目的基因片段的重組質(zhì)粒。

圖2 PCR電泳分析及重組質(zhì)粒pET35b(+)-Z-Cys的雙酶切分析Fig.2 Analysis of PCR product and restriction enzyme of the recombinant plasmid

SPA的B結(jié)構(gòu)域通過C末端殘留的多肽鏈，結(jié)合鄰近IgG的Fc端［16］。因而，選擇將SPA改造后的Z結(jié)構(gòu)域插入到質(zhì)粒pET35b(+)中CBD的 C末端，并新增1個(gè)Cys，設(shè)計(jì)了全長為690 bp的基因重組序列，成功構(gòu)建了pET35b(+)-Z-Cys融合表達(dá)載體。

2.2 CBD-Protein Z融合蛋白的表達(dá)

載有重組質(zhì)粒 pET35b(+)-Z-Cys的 E.coli BL21在OD值達(dá)到0.6～1.0后，經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，超聲破碎并收集菌體蛋白，稀釋至一定濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明，在IPTG的誘導(dǎo)下，目的蛋白得以表達(dá)，與預(yù)期的蛋白相對分子質(zhì)量2.53×104相符(圖3)。由圖3可知:隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量也隨之增加，在濃度為0.8～1.2 mmol/L時(shí)，表達(dá)量最高，并且不隨IPTG濃度的增大而繼續(xù)增加，表達(dá)量基本不變。實(shí)驗(yàn)最后確定本重組菌在OD值達(dá)到0.6～1.0后，選用濃度為1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果最佳。

圖3 SDS-PAGE電泳分析不同IPTG濃度誘導(dǎo)CBD-Protein Z融合蛋白的表達(dá)量Fig.3 SDS-PAGE analysis of CBD-Protein Z fusion protein expressed in E.coli BL21 transformant on different concentrations of IPTG

2.3 CBD-Protein Z融合蛋白與SPA結(jié)合活性鑒定

為證明CBD-Protein Z融合蛋白具有與IgG的結(jié)合活性，選取了HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果見圖4，如果存在能被顯色且蛋白相對分子質(zhì)量與預(yù)期相符的蛋白條帶，則說明表達(dá)的融合蛋白具有與IgG結(jié)合的活性。由圖4可知:在蛋白相對分子質(zhì)量為2.5×104的附近，有1條與目的蛋白相對分子質(zhì)量相符的明顯顯色條帶，說明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白具有與IgG的結(jié)合活性。

圖4 Western Blot鑒定CBD-Protein Z融合蛋白與IgG的結(jié)合活性Fig.4 Western Blot Analysis of CBD-Protein Z fusion protein binding to IgG

重組質(zhì)?？杀磉_(dá)相對分子質(zhì)量為2.53×104的重組蛋白。這種SPA重組蛋白相對分子質(zhì)量小，易表達(dá)的同時(shí)能降低菌體生產(chǎn)強(qiáng)度。該重組蛋白具有與IgG結(jié)合的特異性，末端帶有的His肽段并不影響Z結(jié)構(gòu)域的生物活性，可用于表達(dá)蛋白的純化，事后可以用酶切除。改造后的Z結(jié)構(gòu)域能使IgG的洗脫條件變得溫和，保護(hù)IgG的蛋白質(zhì)活性不受影響，可作為一種較為理想的分離和純化IgG的材料。

2.4 CBD-Protein Z融合蛋白與纖維素結(jié)合活性鑒定

重組菌超聲破碎上清中的CBD-Protein Z融合蛋白通過微晶纖維素親和層析柱，結(jié)果見圖5，如果在流穿液中的目的蛋白條帶消失或變淡，且洗脫液中存在目的蛋白條帶，則說明表達(dá)的蛋白具有與纖維素結(jié)合的活性。由圖5可知:在與纖維素作用后的流穿液中，重組蛋白條帶明顯變淡，而洗脫液中存在蛋白相對分子質(zhì)量與目的蛋白相符的蛋白條帶，說明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白具有與纖維素結(jié)合的活性。

圖5 CBD-Protein Z融合蛋白與纖維素的結(jié)合活性鑒定Fig.5 Analysis of CBD-Protein Z fusion protein binding to Cellulose

重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白在CBD的活性作用下作為親和層析配基使用時(shí)，能定向伸展在基質(zhì)外側(cè)，這樣的順向分子能夠提高IgG的載量。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，末端新引入的—SH能結(jié)合并活化介質(zhì)，增加對IgG的吸附容量［17］，提高蛋白配基的使用效率。使用的基質(zhì)纖維素具有一定的剛性，抗壓性能良好，上樣流速能有一定幅度的提高，能夠縮短純化時(shí)間，提高工作效率。這些效能可以通過與單純的SPA或Z結(jié)構(gòu)域蛋白的比較得以體現(xiàn)。

3 結(jié)論

針對傳統(tǒng)SPA親和層析存在的使用效率低、抗壓性能較差以及毒性殘留等問題，設(shè)計(jì)出一種新的免疫親和材料。構(gòu)建的含有CBD和Z基因的質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的重組菌表達(dá)出的重組融合蛋白CBDProtein Z，其活性檢測結(jié)果證明具有IgG和纖維素的結(jié)合活性。

對于將來作為工程菌的蛋白表達(dá)條件，本研究僅具體探究了誘導(dǎo)劑濃度對蛋白表達(dá)作用的影響，并沒有對其他表達(dá)條件做深入探究。本研究也為利用基因工程等技術(shù)生產(chǎn)應(yīng)用型SPA提供了一條新的借鑒思路。

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