高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的宏觀形態(tài)

代 軍，趙根海，王 鵬，劉 會，宋均營，胡以華，鄭之明

(1.中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 離子束生物工程學(xué)重點實驗室，合肥 230031;2.解放軍電子工程學(xué)院，合肥 230037)

微生物油脂又稱單細胞油脂(SCO)，是指某些微生物在一定條件下將碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂等C源轉(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量儲存的油脂，并且油脂量一般占菌體干質(zhì)量的20%以上。產(chǎn)油脂微生物主要有酵母、真菌、微藻和細菌，其中以對酵母菌和絲狀真菌的研究居多，少數(shù)產(chǎn)油微生物能在胞內(nèi)積累超過細胞干質(zhì)量70%的油脂［1－2］。早期微生物油脂的研究主要集中在功能性油脂的開發(fā)上，隨著國際能源危機和國內(nèi)生物柴油產(chǎn)業(yè)面臨的原料困境，以微生物油脂進行生物柴油生產(chǎn)的研究日益受到關(guān)注。微生物發(fā)酵法與依賴油料植物獲得油脂的傳統(tǒng)方法相比，有周期短、不受季節(jié)和氣候影響、原料來源廣泛、潛力大等優(yōu)點，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景［3］。高山被孢霉(Mortierella alpina)由于胞內(nèi)合成的油脂富含一種功能性多不飽和脂肪酸花生四烯酸(ARA)而備受關(guān)注［4］。

在絲狀菌的深層發(fā)酵過程中，菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)會顯著影響發(fā)酵液的流變性質(zhì)。當菌絲呈球狀生長時，培養(yǎng)液黏度較低，通常發(fā)酵液表現(xiàn)為牛頓型流體特性，在深層培養(yǎng)中的動量、熱量和質(zhì)量傳遞較為容易，當球逐漸增大時，菌絲球由外到內(nèi)形成營養(yǎng)梯度，營養(yǎng)成分向球中心擴散受到限制，內(nèi)部菌絲體的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)下降［5－7］;而當菌絲呈絲狀生長時，發(fā)酵液黏度較高，發(fā)酵液表現(xiàn)為非牛頓流體特性，液體流動性差，導(dǎo)致動量、熱量和質(zhì)量傳遞困難，容易因混合不充分造成氣液相間傳熱和傳質(zhì)不良，最終也會影響代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)［8］。菌絲體微觀形態(tài)的微小差異都有可能導(dǎo)致宏觀發(fā)酵行為的顯著差異，實現(xiàn)發(fā)酵過程中理想的形態(tài)控制是發(fā)酵調(diào)控的重要途徑［9］。對影響形態(tài)的因素，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)進行了大量研究，結(jié)果表明溶氧、N源種類、消耗的C/N比、無機鹽離子和氨基酸的添加等因素都會影響到菌絲的形態(tài)［10－13］。雖然，形態(tài)的重要性無可置疑，但培養(yǎng)基成分、形態(tài)發(fā)生及微生物產(chǎn)ARA水平三者間的關(guān)系還不太明晰，將其關(guān)聯(lián)起來進行的研究更是鮮有報道。

筆者所在實驗室通過氮離子注入獲得Mortierella alpina I49-N18，對其發(fā)酵過程中的不同形態(tài)與產(chǎn)ARA能力進行研究，并采用圖像處理方法對形態(tài)參數(shù)進行量化分析，旨在為下一步對菌絲球形態(tài)控制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石油醚(沸點30～60℃)市售分析純，SBA-50B型生物傳感分析儀(山東省生物技術(shù)研究中心)，250 mL直滴式索式提取器(鄭州中天實驗儀器有限公司)，體視鏡(日本Olympus公司)，GC-14C氣相色譜儀(Shimaozdu公司)。

1.2 菌種與培養(yǎng)方法

高山被孢霉(Mortierella alpina)I49-N18，中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點實驗室保存。平板保存培養(yǎng)基:馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 80、不同 N 源((NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、KNO3、酵母粉、蛋白胨、玉米漿和蛋白胨 +酵母粉)20，pH 8.5。培養(yǎng)基115℃、滅菌30 min。菌種在平板PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d，用少許無菌水洗脫，玻璃珠振蕩至形成分散的孢子懸液，按10%接種量接入含有50 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng) 7 d。

1.3 分析方法

生物量測定:用紗布將發(fā)酵液過濾，并用水沖洗幾次，在80℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量。

菌體總脂測定:利用直滴式索式提取法測定。具體方法為干菌體用研缽磨碎成粉末后，取1.0～1.5 g，在索氏提取器中，石油醚60℃不斷回流提取(6 h)，收集全部回流液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚;80℃烘干，稱干質(zhì)量，計算油脂比例。

花生四烯酸比例測定:參照文獻［14］，利用氣相色譜法測定。

發(fā)酵液殘?zhí)菨舛葴y定:采用SBA-50B生物傳感分析儀進行離線葡萄糖測定，檢測范圍在0～1 g/L。

1.4 形態(tài)參數(shù)的獲取

各種形態(tài)的發(fā)酵液中，隨機取20個菌體用體視鏡進行圖像采集，利用菌絲體顯微圖像分割及特征提取軟件(2011R11S044664)，先進行灰度運算，使圖像對比度增強，再經(jīng)過全局二值化運算去除背景和噪聲，得到黑白圖像，根據(jù)圖像中不同的灰度值，通過閾值調(diào)整得到成核區(qū)域，分別計算其成核區(qū)域面積(Apc)與整個菌體投影面積(Am)，并計算其比值，用來衡量菌體形態(tài)的蓬松程度。菌體直徑Dm利用Image J2x軟件計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一N源對形態(tài)的影響

考察不同N源發(fā)酵對被孢霉的形態(tài)的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知:加入不同N源進行發(fā)酵，被孢霉的形態(tài)差異明顯。當無機氮作N源時，菌體不生長，有機氮作N源時，菌體形態(tài)呈現(xiàn)出很大區(qū)別，主要分為兩類:一類是酵母粉或玉米漿作N源時，菌體形成分散菌絲(圖1(a));另一類是蛋白胨作N源時，菌體形成球形(圖1(b))。

圖1 單一N源下高山被孢霉的宏觀形態(tài)(×8)Fig.1 Macro-morphology of M.alpina under sole nitrogen source(dispersed mycelia and hollow pellets)(×8)

2.2 復(fù)合N源對形態(tài)的影響

2.2.1 不同宏觀形態(tài)分析

分別按照表1中的比例添加蛋白胨和酵母粉作為復(fù)合N源，進行發(fā)酵，觀察菌體形態(tài)，形態(tài)特征數(shù)據(jù)見表1，菌體宏觀形態(tài)見圖2。

表1 復(fù)合N源下菌體宏觀形態(tài)的形態(tài)特征Table 1 Macro-morphologicalcharacteristic parameters under complex nitrogen source

由表1可知:復(fù)合N源中蛋白胨與酵母粉比例降低，菌體形態(tài)明顯不同，總的變化為Apc/Am降低，菌球的成核區(qū)域比例越來越小，菌球的蓬松度增加，單個菌體的直徑變大。蛋白胨與酵母粉比例為3∶1時，菌體形態(tài)為球形，成核區(qū)域占81.1%;比例為2∶1時，菌體形態(tài)也為球形，但成核面積只占43.6%;比例為1∶2時，菌體形態(tài)完全為分散菌絲，不存在成核區(qū)域;菌體形態(tài)為球形時直徑大致相同，4.3 mm左右;形態(tài)為分散菌絲時，直徑增至6 mm。雖然蛋白胨與酵母粉比例為3∶1和2∶1時菌體形態(tài)都為球形，但成核區(qū)域直徑和單個菌球的緊密度差異明顯，分別為3.88 mm、42.27和2.91 mm、71.36?？招那蛐涡螒B(tài)由于成核區(qū)域直徑較大，菌球中心部位菌絲因為營養(yǎng)缺乏而自溶，形成空心球，同時其葡萄糖利用率只有55%;蓬松球形態(tài)的菌絲不存在營養(yǎng)缺乏等問題，形成蓬松球，其葡萄糖利用率高達97%。上述結(jié)果表明，蛋白胨有利于菌絲聚集成球，酵母粉有利于菌絲頂端生長，形成輻射狀菌絲，其原因可能是，酵母粉作為速效N源，含有豐富的生長因子、維生素、核苷酸等適合菌絲快速萌發(fā)生長的微量物質(zhì)，蛋白胨作為緩效N源，不利于菌絲快速生長，菌絲生長過程中容易聚集在一起。因此，在高山被孢霉發(fā)酵過程中，確定復(fù)合N源中蛋白胨和酵母粉的比例對形成合適的菌體形態(tài)至關(guān)重要。

圖2 復(fù)合N源下高山被孢霉的3種典型宏觀形態(tài)(×8)Fig.2 Three typical macro-morphologies of M.alpina under complex nitrogen source(×8)

2.2.2 宏觀形態(tài)對菌體產(chǎn)ARA能力的影響

高山被孢霉在蛋白胨與酵母粉比例不同的復(fù)合N源中以不同的形態(tài)生長，發(fā)酵結(jié)束時對生物量、油脂比例及ARA比例進行測定，具體結(jié)果見表2。

由表2知:菌體形態(tài)以空心球形態(tài)生長時，生物量最低，菌體油脂比例最高，ARA比例較高;以蓬松球形態(tài)生長時，生物量最高，菌體油脂比例較高，ARA比例最高;以分散菌絲生長時，生物量較高，菌體油脂比例及ARA比例最低。ARA量由生物量、油脂比例及油脂中ARA比例共同決定，因此球形形態(tài)菌體ARA產(chǎn)量比分散菌絲菌體ARA產(chǎn)量高，特別是以蓬松球形態(tài)生長時，其ARA產(chǎn)量達2.98 g/L，分別是空心球和分散菌絲的2.01和2.70倍。

表2 菌體的不同宏觀形態(tài)對ARA合成的影響Table 2 Effects of different macro-morphologies on mycelial lipid production

ARA作為一種多不飽和脂肪酸，雖然不是含氮化合物，但其比例與N源種類密切相關(guān)，其在菌體內(nèi)的合成需要多種延長酶和脫飽和酶參與，此過程對O2的依賴程度非常高［15］。由表2知，隨著復(fù)合N源中酵母粉比例的增加，生物量和ARA比例增加，形態(tài)由球形變?yōu)榉稚⒕z。當菌體以分散菌絲形式生長到中后期，發(fā)酵液黏度非常大，不利于發(fā)酵液中營養(yǎng)和O2等的傳遞，菌體生長受到抑制，同時也不利于ARA合成，因此生物量和氨基酸比例都有所降低。

Park 等［11］和 Koike等［12］研究了消耗的 C/N 及不同N源對高山被孢霉形態(tài)和ARA產(chǎn)量的影響，但未對菌體形成不同形態(tài)的原因展開分析，本研究通過調(diào)節(jié)復(fù)合N源中蛋白胨與酵母粉比例，得到了相對連續(xù)的菌絲體形態(tài)變化過程，即菌絲體的成核區(qū)域比例由81.1%(空心球)降為43.6%(蓬松球)，最后為0(分散菌絲)，顯示了不同形態(tài)間的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)合不同形態(tài)下菌絲的生長情況發(fā)現(xiàn)速效N源有利于形成分散菌絲，遲效N源傾向于使菌絲聚集。因此，調(diào)節(jié)兩類N源的比例，有助于篩選最適于目標產(chǎn)物生成的發(fā)酵形態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，當復(fù)合N源中蛋白胨與酵母粉比例為2∶1時，高山被孢霉菌體形態(tài)為類似菊花瓣狀蓬松球，其為最適合油脂積累及ARA轉(zhuǎn)化合成的發(fā)酵形態(tài)。

3 結(jié)論

蛋白胨、酵母粉這2種N源是影響高山被孢霉宏觀形態(tài)的重要因素，當復(fù)合N源中蛋白胨與酵母粉比例很高時，菌體形態(tài)為空心球，比例適當時為“類似菊花瓣”的蓬松球，比例很低時為分散菌絲。高山被孢霉不同的發(fā)酵形態(tài)，其菌體產(chǎn)ARA能力存在較大差異。ARA作為一種胞內(nèi)產(chǎn)物，產(chǎn)量由菌體生物量、菌體油脂比例及油脂中ARA比例共同決定。當高山被孢霉以分散菌絲形態(tài)生長時，菌體產(chǎn)ARA能力不如球形形態(tài);而空心球的菌體生物量低，蓬松球可以兼顧菌體高生物量、高油脂比例及高ARA比例，因此具有很高的產(chǎn)ARA能力，其產(chǎn)ARA能力分別是空心球和分散菌絲的2.01和2.70倍。綜上所述，菌體形態(tài)特征為直徑大約4 mm、Apc/Am為0.436、投影面積為15.27 mm2、成核區(qū)域直徑2.9 mm、緊密度大約為71.36的蓬松球，是高山被孢霉發(fā)酵過程中適合油脂積累及ARA轉(zhuǎn)化的典型形態(tài)，既排除了空心球中心部分的傳質(zhì)及空氣傳遞等問題，又不會因為過多的分散菌絲導(dǎo)致發(fā)酵液黏度變大，從而有利于工業(yè)生產(chǎn)過程中發(fā)酵液攪拌及下游濕菌體的分離。

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