枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵米糠及其對臨武鴨生長性能的影響

歐榮娣，邢月騰，范覺鑫，張 彬，李麗立

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物生態(tài)營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實驗室農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，長沙 410125）

米糠是稻谷加工后的副產(chǎn)物，主要用作畜禽飼料，含有64%的稻米營養(yǎng)素[1]。但在我國其所具有的營養(yǎng)價值和資源效益并未得到充分發(fā)揮，造成一定的資源浪費。同時，微生態(tài)制劑作為一種綠色環(huán)保、安全有效的飼料添加劑，在畜禽飼料中應(yīng)用越發(fā)廣泛，但是對于如何合理、高效的使用該類產(chǎn)品還存在一定爭議[2]。本試驗利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵米糠，并拌入日糧中飼喂臨武鴨測定其生長性能，以期優(yōu)化發(fā)酵路線，合理利用米糠，并為枯草芽孢桿菌制劑在肉鴨生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

試驗所選菌種為中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物生態(tài)營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實驗室在豬回腸中篩選保存的枯草芽孢桿菌，其賴氨酸（Lys）產(chǎn)量為33.05μg·mL-1。

1.1.2 試驗動物

選擇1日齡體重接近、健康狀況良好的雌性臨武鴨240羽，由湖南臨武舜華鴨業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司提供。

1.2 米糠發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

1.2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線的繪制

取250mL三角瓶若干，標(biāo)記好培養(yǎng)時間。設(shè)置培養(yǎng)時間梯度 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h，每個梯度設(shè)置3個平行。將菌株P(guān)L83在LB液體培養(yǎng)基中37℃、200 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)16～18 h，然后在含有100mL LB培養(yǎng)基的39個250mL錐形瓶中分別接入菌液1mL，37℃恒溫?fù)u床200 rpm振蕩培養(yǎng)。在相對應(yīng)的時間取出三角瓶測定菌液OD600值。根據(jù)OD600值繪制芽孢桿菌生長曲線。

1.2.2 米糠固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

本試驗擬對影響發(fā)酵效果的3個因素進行3水平的考察，分別為水分含量35%、45%、55%，菌種添加量1%、3%、5%和發(fā)酵時間l、3、5 d，發(fā)酵溫度為37℃，粗蛋白質(zhì)測定方法參照GB/T6432-94（飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法）。

1.2.3 發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)的變化

主要測定發(fā)酵前與發(fā)酵優(yōu)化后產(chǎn)物氨基酸含量變化。氨基酸測定方法參照GB/T18246-2000（飼料中氨基酸的測定）。

1.3 臨武鴨飼喂發(fā)酵米糠試驗

1.3.1 飼養(yǎng)飼料

試驗基礎(chǔ)飼糧不添加任何抗生素，其營養(yǎng)水平參照美國NRC（1994）肉鴨營養(yǎng)需要和臨武鴨對Lys營養(yǎng)需要進行設(shè)計，米糠根據(jù)試驗結(jié)果所確定的最佳發(fā)酵工藝條件進行擴大發(fā)酵，發(fā)酵后的產(chǎn)品風(fēng)干后配合成全價料?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成與營養(yǎng)水平 DM

1.3.2 試驗設(shè)計

采用單因子隨機設(shè)計，選擇1日齡體重接近、健康狀況良好的雌性臨武鴨240羽隨機分為4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20羽。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加金霉素（有效含量15%）150mg·kg-1；試驗Ⅰ和Ⅱ組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加枯草芽孢桿菌5×108和5×1010cfu·kg-1，并去除賴氨酸添加劑（0.15%）[3]。仔鴨于室內(nèi)同一環(huán)境下網(wǎng)上平養(yǎng)，每重復(fù)1欄，電熱控溫，自由采食和飲水，免疫接種、疾病預(yù)防和消毒等按常規(guī)方法進行，試驗期21 d。

1.4 測定指標(biāo)與方法

飼養(yǎng)試驗開始和結(jié)束時，對各重復(fù)鴨進行稱重，記錄初始重和末重，計算各重復(fù)鴨平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G），統(tǒng)計死亡率。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件的GLM ANOVA進行顯著性分析，Duncan's法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PL83菌株生長曲線

枯草芽孢桿菌PL83的生長曲線見附圖。

附圖 PL83菌株的生長曲線

由附圖可知，0～4 h為菌體生長停滯期，菌體數(shù)量極少；從4 h后進入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急劇增多；9 h后處于生長的穩(wěn)定期，菌體生長緩慢；11 h后，菌體開始進入生長的衰亡期，菌數(shù)明顯減少。因此，發(fā)酵時接種約9～10 h的菌體進入對數(shù)生長末期，既可保持高的細菌活力，又可獲得盡可能多的菌數(shù)。此時菌液OD值為1.73，通過平板計數(shù)法，測得菌液含菌量為1.5×109cfu·mL-1。

2.2 米糠固態(tài)發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

試驗直觀分析見表2，不同發(fā)酵條件粗蛋白質(zhì)含量的單因變量方差分析見表3。

試驗結(jié)果表明，在不同條件米糠發(fā)酵中，發(fā)酵時間對粗蛋白質(zhì)含量作用最大，其次是水分，最后是菌體種子接種量，但后兩者所起作用差異不顯著。從表2可知，當(dāng)水分含量為35%、接種量為3%、發(fā)酵時間為5 d時，發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量最高。

表2 試驗直觀分析

表3 不同發(fā)酵條件粗蛋白質(zhì)含量的單因變量方差分析

2.3 發(fā)酵米糠成分分析結(jié)果

選擇粗蛋白質(zhì)含量最高的發(fā)酵產(chǎn)物，采用氨基酸自動分析儀分析發(fā)酵前后產(chǎn)品中氨基酸的含量，米糠發(fā)酵前后氨基酸的含量見表4。

由表4可知，米糠經(jīng)過固體發(fā)酵后，15種氨基酸中，有13種氨基酸組分不同程度提高，其中賴氨酸含量提高22.83%，纈氨酸含量提高37.66%，脯氨酸提高43.06%，只有丙氨酸、半胱氨酸含量減少。

2.4 飼喂發(fā)酵米糠對臨武鴨生產(chǎn)性能的影響

枯草芽孢桿菌PL83對21日齡臨武鴨生長性能的影響見表5。

根據(jù)實驗室米糠固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化得出的結(jié)果，選擇水分含量為35%、接種量為3%、發(fā)酵時間為5 d的條件進行米糠擴大發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)干后制成配合飼料飼喂1日齡臨武鴨。

表4 米糠發(fā)酵前后氨基酸的含量

表5 枯草芽孢桿菌PL83對21日齡臨武鴨生長性能的影響

3 討 論

3.1 米糠固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

通常以米糠為主要發(fā)酵基質(zhì)時，含水量應(yīng)以捏緊米糠指縫滲水且米糠能松散為宜，若含水量較少，菌體生長代謝所需水分可能不足；而水分過多，米糠成糊狀，將影響菌體的需氧性和活動性。另外，菌液接種量決定了菌種在發(fā)酵過程中生長繁殖的速度。發(fā)酵時間也是衡量發(fā)酵效果的重要因素，發(fā)酵前期基質(zhì)營養(yǎng)豐富，此時菌體大量繁殖，生成大量菌體蛋白；到了后期，基質(zhì)的營養(yǎng)不能滿足菌體生長需要，發(fā)酵菌體就會進入衰亡期，同時也會增加染菌機會和生產(chǎn)成本[4]。試驗結(jié)果表明，在3個影響因子共同作用下，其影響力為發(fā)酵時間＞水分含量＞接種量，且在發(fā)酵時間5 d、水分含量35%、接種量3%的條件下，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量最高可達20.34%。

3.2 發(fā)酵米糠成分

本試驗通過對米糠發(fā)酵產(chǎn)物進行氨基酸分析，結(jié)果顯示，測定的15種氨基酸中，絕大部分的氨基酸有不同程度的提高，且包含大部分必需氨基酸，其中脯氨酸提高43.06%，纈氨酸含量提高37.66%，賴氨酸含量提高22.83%，只有丙氨酸、半胱氨酸含量減少，這可能是因為在發(fā)酵過程中用于細菌的生長，且這兩種氨基酸都屬于非必須氨基酸，對于飼料的營養(yǎng)價值影響不大。

3.3 飼養(yǎng)試驗

目前國內(nèi)外關(guān)于枯草芽孢桿菌對畜禽生產(chǎn)性能影響的研究較多，多集中在豬和雞，對在鴨生產(chǎn)中的應(yīng)用研究相對較少。劉小英在櫻桃谷肉鴨飼料中添加枯草芽孢桿菌2.0×109cfu·kg-1，提高了肉鴨的增重，降低了料肉比[5]。劉曉琳等研究表明，在櫻桃谷肉鴨飼糧中添加枯草芽孢桿菌1.0×1010cfu·kg-1對肉鴨的增重有極顯著的促進作用，育成率也大幅提高[2]。王敏奇等在紹興鴨飼料中添加枯草芽孢桿菌1.0×105cfu·g-1，顯著提高紹興鴨產(chǎn)蛋率（P＜0.05）[6]。韓廷義對櫻桃谷肉鴨飼喂含枯草芽孢桿菌制劑0.5%的飼糧后，體重增加，試驗?zāi)┢隗w重可提高15.52%，料重比顯著降低[7]。Sheng等研究表明，在飼糧中添加枯草芽孢桿菌0.2%和0.4%，可顯著改善麻鴨的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[8]。本試驗中添加枯草芽孢桿菌YB83 5.0×108和5.0×1010cfu·kg-1的試驗組與對照組相比平均日增重分別提高0.72%和0.82%，料重比分別改善0.14%和0.19%，兩組間無顯著差異（P＞0.05），與鄭春芳等研究結(jié)果一致[9]。翟玲等在雛公雞基礎(chǔ)日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑0.75 g·kg-1，結(jié)果表明，與對照組相比，日糧中添加枯草芽孢桿菌分別提高前期肉雞的體質(zhì)量和日增重（P＞0.05），后期肉雞的體質(zhì)量和日增重分別提高6.72%（P＜0.05）和13.69%（P＜0.05），全程肉雞的體質(zhì)量和日增重分別提高6.75%（P＜0.05）和8.22%（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌對肉雞采食量影響不顯著（P＞0.05）；料重比在試驗前期有所提高，試驗后期和全程均呈下降趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗組肉雞血清中總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（SOD）、超氧化物歧化酶（GSH-Px）分別比對照組提高25.75%（P＜0.05）、20.10%（P＜0.05）和18.12%（P＜0.05），丙二醛（MDA）含量有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），枯草芽孢桿菌可提高肉雞的抗氧化能力、減少氧化應(yīng)激，提高肉雞生長性能[10]。其改善效果不顯著，但已朝好的方向發(fā)展，原因可能是飼喂臨武鴨時間短暫。添加枯草芽孢桿菌YB83能極顯著地降低臨武鴨的死亡率，其原因是枯草芽孢桿菌YB83能增強臨武鴨的免疫機能及抑制腸道內(nèi)有害菌的生長，從而達到減少疾病、提高成活率的效果。金霉素對臨武鴨的生長表現(xiàn)出一定的促進作用，其效果要優(yōu)于枯草芽孢桿菌YB83，但長時間的使用會引起藥物殘留、耐藥性等問題。在本試驗中，高劑量枯草芽孢桿菌YB83試驗組比低劑量試驗組對臨武鴨生產(chǎn)性能的改善作用并不顯著，與Li等結(jié)果吻合[11]。可能是由于過量的微生物存在于腸道，使腸道蠕動增強，因此影響了營養(yǎng)的消化吸收；其他的有益微生物被改變以至于共存環(huán)境被破壞，因此存在枯草芽孢桿菌的劑量效應(yīng)。

4 結(jié)論

枯草芽胞桿菌的最佳生長時間為9～10 h，米糠固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵時間5 d、水分含量35%、接種量3%，其蛋白質(zhì)含量可提高到20.34%。日糧中添加枯草芽孢桿菌可有效的提高臨武鴨平均日增重，降低料肉比和死亡率。但枯草芽孢桿菌的添加效果還受到日糧組成、動物的種類、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境條件等因素的影響和制約。因此，枯草芽孢桿菌的適宜添加量還需要進一步研究。

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