大豆肽的生理功能和制備工藝

王勇生，程宗佳

（中糧營養(yǎng)健康研究院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料中心，北京 102209）

蛋白質(zhì)營養(yǎng)實(shí)際上是氨基酸營養(yǎng)。蛋白質(zhì)在動(dòng)物消化酶作用下的水解終產(chǎn)物大部分是由2或3個(gè)氨基酸殘基組成的小肽，能直接被動(dòng)物吸收，參與生理活動(dòng)和代謝調(diào)節(jié)。大豆蛋白活性肽是大豆蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，通過微生物發(fā)酵技術(shù)將大豆蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成多肽、寡肽以及小部分氨基酸混合物，通常平均肽鏈長度為2～10的短肽（以長度為2～3的低分子肽為主），含少量的游離氨基酸、糖類和無機(jī)鹽，相對(duì)分子質(zhì)量＜1 000，主要溶出峰位置在相對(duì)分子質(zhì)量為300～700。與大豆蛋白質(zhì)相比，大豆多肽含豐富的小肽，更易消化吸收，具有低過敏性，能促進(jìn)礦物質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)元素的吸收及抗氧化等特性。幼畜（對(duì)于早期斷奶的動(dòng)物）的消化酶系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對(duì)于植物蛋白質(zhì)的消化能力較弱，而大豆肽中富含許多小肽，且大豆肽抗原性較低，能直接被動(dòng)物吸收，因而幼畜使用后發(fā)生過敏反應(yīng)的概率大幅降低。本文就大豆肽的生理功能和制備工藝進(jìn)行論述，以期為大豆肽作為飼料資源的開發(fā)使用，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能提供指導(dǎo)。

1 大豆肽的生理功能

1.1 降低膽固醇

大豆肽能刺激甲狀腺激素分泌，促使膽固醇代謝生產(chǎn)膽汁酸。膽汁酸又被食物纖維所吸附，排出體外從而阻礙對(duì)膽固醇的吸收，起到降低膽固醇的作用[1]。對(duì)于膽固醇值高的人有降低總膽固醇作用，對(duì)于正常人無降低作用，還可以預(yù)防患者在食用高膽固醇食品時(shí)所引起的膽固醇升高的現(xiàn)象。在細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物模型中研究表明，大豆蛋白作用機(jī)制與直接激活肝細(xì)胞中的低密度脂蛋白受體或者基因表達(dá)有關(guān)[2-3]?；蚺c大豆蛋白中特殊比例的氨基酸調(diào)控低密度脂蛋白合成與代謝有關(guān)[4-5]。Lovati等研究表明，大豆蛋白中的主要小肽（即7S球蛋白），無異黃酮元件，在HepG2細(xì)胞中可抑制載脂蛋白B分泌和甾醇生物合成[2,6]。在Ⅱ型糖尿病小鼠中的研究表明，大豆蛋白水解產(chǎn)物不僅能抑制脂質(zhì)的吸收，增加碳水化合物的吸收而且增強(qiáng)餐后食物中的碳水化合物的氧化，增加能量消耗[7]。

1.2 促進(jìn)脂肪代謝

Nagasawa等報(bào)道，大豆蛋白肽可以降低脂肪組織中甘油三酯含量和脂肪酸合成酶mRNA水平，表明大豆分離蛋白控制脂肪組織中基因的表達(dá)，并有效調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[8]。此外，黑色大豆肽可降低肥胖發(fā)生率，起到降低體重，減少脂肪合成作用，有減少體重和脂肪組織重量的優(yōu)點(diǎn)。Kim等從大豆中獲得一種三肽，經(jīng)過Western blot分析表明，合成肽與5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）具有相似的抑制效果，可以抑制脂肪細(xì)胞標(biāo)記物和脂肪細(xì)胞分化因子的表達(dá)分化[9]。高長城等報(bào)道，給小白鼠飼喂大豆肽時(shí)能刺激產(chǎn)生熱能的褐色脂肪組織BAT的活性，提高甲狀腺在血液中的濃度，并隨大豆肽服用量的增加而提高[10]。

1.3 抗氧化功能

高水平的活性氧可導(dǎo)致機(jī)體DNA、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的損害[11]。大豆蛋白水解物中含有抗氧化肽，這些肽具有很高的活性，可抑制亞油酸的過氧化，緩解百草枯誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，清除過氧化亞硝酸鹽、活性氧和自由基物質(zhì)[12-13]。因此，可能有助于預(yù)防一些自由基有關(guān)的疾病。Chen等從大豆蛋白質(zhì)的酶解液中分離得到6種具有抗氧化性的多肽，發(fā)現(xiàn)此類多肽由5～16個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括疏水的氨基酸、纈氨酸或亮氨酸在N-末端，然后在肽段順序上是脯氨酸、組氨酸或酪氨酸。其共同特點(diǎn)為含有較多的組氨酸和酪氨酸，推測其抗氧化性主要是由于組氨酸和酪氨酸能消除自由基或整合金屬離子。

1.4 增強(qiáng)免疫功能

Dilshat等研究表明，當(dāng)人體淋巴細(xì)胞較多時(shí)，大豆肽可以降低人體淋巴細(xì)胞數(shù)目，同時(shí)粒細(xì)胞數(shù)目也會(huì)增多；當(dāng)人體粒細(xì)胞較多時(shí)，大豆肽可以提高淋巴細(xì)胞數(shù)目，同時(shí)粒細(xì)胞也有增多趨勢(shì)，并且大豆肽可顯著提高CD11b+和CD56+數(shù)目（P＜0.05）[14]。Takahiro等在大豆蛋白的胰蛋白酶水解液中提取得到一種肽soymetide-13（來源于β-伴大豆球蛋白的α'亞基），具有刺激中性粒細(xì)胞的吞噬功能，soymetide-13的N-末端對(duì)這種刺激作用起主要作用，在去除C-末端后，發(fā)現(xiàn)soymetide-4是所需吞噬刺激作用的最小結(jié)構(gòu)[15]。李紅勝等研究了大豆肽對(duì)小鼠免疫器官和免疫功能的影響，結(jié)果表明，日糧中添加大豆肽可顯著提高小鼠免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，激發(fā)小鼠抗雞紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，說明大豆肽對(duì)免疫小鼠抗雞紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生具有明顯的激發(fā)作用，可在一定程度上提高小鼠特異性免疫功能[16]。

1.5 促進(jìn)鈣及微量元素吸收作用

由于大豆蛋白中植酸、草酸、纖維、單寧及其他多酚的存在，顯著抑制了動(dòng)物對(duì)鈣、鋅、銅、鎂和鐵的生物利用率。研究表明，大豆肽能與鈣及其他微量元素有效結(jié)合成活性基團(tuán)，可以形成有機(jī)鈣多肽絡(luò)合物，使溶解性、吸收率和輸送速度都明顯提高，能促進(jìn)鈣的被動(dòng)吸收。此外，大豆肽還能與鐵、銅、硒、鎂和錳等多種微量元素結(jié)合，形成有機(jī)金屬絡(luò)合肽，是吸收和輸送微量元素很好的載體。李迪等研究了不同大豆肽制備鈣肽復(fù)合物的溶解性和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BML-Ca溶解性最好，濃度為200～300mg·mL-1滅菌效果最好[17]。盧建國等研制出的富硒大豆肽膠囊和富硒大豆肽飲料，均有利于人體對(duì)硒的吸收[18]。

2 大豆肽的物理化學(xué)制備工藝

制備大豆肽的原料主要有大豆分離蛋白、大豆粉和大豆粕3種。生產(chǎn)所采用的方法有化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法。目前，應(yīng)用這些方法已獲得一定數(shù)量具有生物活性大豆肽產(chǎn)物。因不同的方法具有不同的工藝條件選擇，所獲得大豆肽的純度、理化性質(zhì)和功能活性各有不同。大豆中獲得的不同生物活性肽見附表[19－26]。

2.1 化學(xué)水解法

化學(xué)水解法包括酸水解法和堿水解法，即采用酸、堿化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子多肽物質(zhì)。酸堿水解法相對(duì)簡單，生產(chǎn)成本低，但存在許多缺點(diǎn)，如水解工藝很難控制，水解無特異性，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，氨基酸易遭到破壞，營養(yǎng)成分損失，對(duì)環(huán)境污染大等。因此，目前的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。

附表 大豆中獲得的不同生物活性肽

2.2 酶水解法

酶水解法是利用蛋白酶在最適溫度和pH條件下進(jìn)行大豆蛋白酶解反應(yīng)，把大分子蛋白降解為小分子肽類，再經(jīng)加工精制生產(chǎn)出大豆肽產(chǎn)品。常用的蛋白酶主要有動(dòng)物蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等及微生物蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶、放線菌蛋白酶、棲土曲霉蛋白酶、黑曲霉蛋白酶和地衣型芽孢桿菌蛋白酶等。酶解法生產(chǎn)多肽產(chǎn)品安全性高，人體易消化吸收，蛋白質(zhì)利用率高，且生產(chǎn)條件溫和，易控制，已逐漸成為應(yīng)用最廣泛的大豆肽制備方法。但酶水解法制備的大豆肽會(huì)產(chǎn)生苦味，其中的苦味物質(zhì)主要是亮氨酸、蛋氨酸等疏水性氨基酸及其衍生物和一些小分子的肽類。此外，高價(jià)格酶制劑的使用也提高了大豆肽的生產(chǎn)成本。

酶水解法可分為單酶水解法、雙酶水解法和復(fù)合酶水解法。在酶解法生產(chǎn)大豆肽的初期研究中，一般采用單酶水解法生產(chǎn)大豆肽，但苦味明顯，加入外切酶水解后，苦味變?nèi)?。多酶?fù)合水解工藝比單酶水解復(fù)雜，底物濃度、酶解時(shí)間、pH、溫度、酶的配比及加入酶的方式等因素都要嚴(yán)格考慮。多酶復(fù)合水解的水解度要高于單酶，能將大豆蛋白降解為相對(duì)分子質(zhì)量小的短肽，使苦味不明顯。

2.3 微生物發(fā)酵法

目前，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)酶，進(jìn)而水解大豆蛋白生產(chǎn)大豆肽被認(rèn)為是一種較先進(jìn)且極其有效的生產(chǎn)活性肽方法。生物活性肽能夠在微生物代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的混合酶作用下釋放出來，同時(shí)微生物可借助多肽水解液提高生長及產(chǎn)酶能力，循環(huán)協(xié)作，效率更高。此法生產(chǎn)的大豆肽不是簡單地將大豆蛋白質(zhì)切成小肽，而是將釋放的小肽通過移接和重排，經(jīng)過微生物作用對(duì)某些苦味基團(tuán)進(jìn)行修飾、轉(zhuǎn)移和重組，使制得的大豆肽具有更好的溶解性，無苦味，增強(qiáng)其應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用較廣的微生物主要有棲土曲霉3942、枯草桿菌1389、地衣芽抱桿菌2709、黑曲霉3350和放線菌166等。微生物發(fā)酵法制備大豆肽的原料成本低廉、工藝過程簡單、條件溫和、發(fā)酵效率高。我國近年來在此領(lǐng)域開展了較多研究，并已獲得了利用復(fù)合菌發(fā)酵大豆粕制備大豆肽的最佳工藝條件，成本低、效率高、產(chǎn)品品質(zhì)好。

3 大豆肽的基因表達(dá)制備策略

近年來，從大豆中分離獲得的各種小分子肽蛋白都表現(xiàn)出各種生理活性，如調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)、激活細(xì)胞免疫機(jī)制、改善心血管系統(tǒng)等。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)功能性食品和新藥物的開發(fā)非常有價(jià)值。利用基因工程技術(shù)在微生物中進(jìn)行異源蛋白質(zhì)的表達(dá)是現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)和利用的熱點(diǎn)。依據(jù)生產(chǎn)效率、生物活性、蛋白質(zhì)的理化特性來選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。Itakura等利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物肽類激素在外源基因的體外表達(dá)[27]。在一般情況下，3種形式的外源蛋白質(zhì)可以在大腸埃希氏菌中表達(dá)：融合蛋白、分泌蛋白和包涵體。大腸桿菌可進(jìn)行翻譯后修飾，例如，N-O-連接糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化、二硫鍵形成，構(gòu)成正確的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)以及所需蛋白質(zhì)的功能特性。顯然，這些修飾可以影響到生物活性、功能、結(jié)構(gòu)、溶解性、穩(wěn)定性、半衰期、蛋白酶阻力。Liu等試驗(yàn)表明，已成功利用了商業(yè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組lunasin大豆肽蛋白[28]。

[1]Friedman M.Nutritionalvalue of food protein from different food sources[J].JAgric Food Chem,1996,44:6-29.

[2]Lovati M R,Manzoni C,Gianazza E,et al.Soy protein peptides regulate cholesterol homeostasis in Hep G2 cells[J].The Journal ofNutrition,2000,130（10）:2 543-2 549.

[3]ManzoniC,DurantiM,Eberini I,etal.Subcellular localization of soybean 7Sglobulin in HepG2 cells and LDL receptorup-regulation by its alpha constituent subunit[J].The Journal of Nutrition,2003,133（7）:2 149-2 155.

[4]Tovar A R,Murguia F,CruzC,etal.Soy protein dietaltershepatic lipidmetabolism gene expression and reduces serum lipids and renal fibrogenic cytokines in ratswith chronic nephrotic syndrome[J].The JournalofNutrition,2002,132（9）:2 562-2 569.

[5]Vahouny GV,Adamson I,ChalcarzW,etal.Effectsof casein and soy protein on hepatic and serum lipids and lipoprotein lipid distributions in the rat[J].Atherosclerosis,1985,56（2）:127-137.

[6]LovatiM R,ManzoniC,CorsiniA,etal.7Sglobulin from soybean ismetabolized in human cell cultures by a specific uptake and degradation system[J].The Journal of Nutrition,1996,126（11）:2 831-2 842.

[7]Ishihara K,Oyaizu S,Fukuchi Y,etal.A soybean peptide isolate diet promotes postprandial carbohydrate oxidation and energy expenditure in type II diabetic mice[J].The Journal of Nutrition,2003,133（3）:752-757.

[8]Nagasawa A,Fukui K,Kojima M,et al.Divergent effects of soy protein diet on the expression of adipocytokines[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,311（4）:909-914.

[9]Kim H J,Bae IY,Ahn CW,etal.Purification and identification of adipogenesis inhibitory peptide from black soybean protein hydrolysate[J].Peptides,2007,28（11）:2 098-2 103.

[10]高長城,胡銳,李煜馨.大豆肽對(duì)增強(qiáng)體能的作用[J].大豆通報(bào),2001（2）:24-25.

[11]Murosaki S,Muroyama K,Yamamoto Y,etal.Antitumor effectof heatkilled Lactobacillus plantarum L-137 through restoration of impaired interleukin-12 production in tumor-bearing mice[J].Cancer Immunology Immunotherapy,2000,49（3）:157-164.

[12]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F,etal.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digestsof a soybean protein[J].Journal of Agriculturaland Food Chemistry.1998,46（1）:49-53.

[13]Takenaka A,Annaka H,Kimura Y,etal.Reduction ofparaquatinduced oxidative stress in ratsby dietary soy peptide[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2003,67（2）:278-283.

[14]YimitD,Hoxur P,AmatN,etal.Effectsofsoybean peptide on immune function,brain function,and neurochemistry in healthy volunteers[J].Nutrition,2012,28（2）:154-159.

[15]Tsuruki T,Kishi K,TakahashiM,et al.Soymetide,an immunostimulating peptide derived from soybean L-conglycinin,is an fMLPagonist[J].FEBSLetters,2003,540（1-3）:206-210.

[16]李紅勝,高存川,謝為天,等.大豆肽對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012（5）:109-111.

[17]李迪,呂瑩,郭順堂.大豆肽鈣復(fù)合物的溶解穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32（4）:94-96.

[18]盧建國,孫強(qiáng),孫潔心.富硒（Se）大豆肽膠囊的制備及其溶出度測定的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27（7）:447-451.

[19]Zhong F,Zhang X,Ma J,etal.Fractionation and identification of anovelhypocholesterolemic peptide derived from soy protein alcalase hydrolysates[J].Food Research International,2007,40（1）:759-762.

[20]Nagaoka S,Futamura Y,Miwa K,etal.Identification of novel hypocholesterol peptides derived from bovinemilk beta-lactoglobulin[J].Biochemistry Biophysics Research Communication,2001,281（1）:11-17.

[21]Kwon D Y,Oh SW,Lee JS,etal.Amino acid substitution ofhypocholesterolemic peptide originated from glycinin hydrolyzate[J].Food Science Biotechnology,2002,11（3）:55-61.

[22]Kim SE,Kim H H,Kim JY,etal.Anticancer activity of hydrophobic peptides from soy proteins[J].Biofactors,2000,12（1-4）:151-155.

[23]Wu J,Ding X.Hypotensive and physiologicaleffectofangiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49（1）:501-506.

[24]Korhonen H,Pihlanto A.Food-derived bioactive peptides-opportunities for designing future foods[J].Current Pharmaceutical Design,2003,9（16）:1 297-1 308.

[25]Kitts D D,Weiler K.Bioactive proteins and peptides from food sources.Applicationsofbioprocessesused in isolationand recovery[J].CurrentPharmaceuticalDesign,2003,9（16）:1 309-1 323.

[26]Yoshikawa M,Fujita H,Matoba N,et al.Bioactive peptides derived from food proteins preventing lifestyle-related diseases[J].Biofactors,2000,12（1-4）:143-146.

[27]Itakura K,Hirose T,Crea R,et al.Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin[J].Science,1977,198（4 321）:1 056-1 063.

[28]Liu CF,Pan TM.Recombinantexpression ofbioactive peptide lunasin in Escherichia coli[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,88（1）:177-186.