臭氧、臭氧水對感染性創(chuàng)面修復作用的分子生物學研究

李云愷，陳麗艷，王 惠，邱思強

(1.濟南第四人民醫(yī)院外五科，山東 濟南 250031；2.濟南第四人民醫(yī)院護理部，山東 濟南 250031；3.濟南市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟南 250012)

臭氧、臭氧水對感染性創(chuàng)面修復作用的分子生物學研究

李云愷1，陳麗艷2，王 惠3，邱思強1

(1.濟南第四人民醫(yī)院外五科，山東 濟南 250031；2.濟南第四人民醫(yī)院護理部，山東 濟南 250031；3.濟南市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟南 250012)

目的 運用分子生物學的方法探討臭氧水和臭氧對創(chuàng)面愈合的療效。方法40只Vista大鼠感染性創(chuàng)面造模成功后按換藥方式的不同隨機分為四組：洗必泰治療組、臭氧組、臭氧水組、對照組，每組各10只；換藥9 d后評價四組大鼠創(chuàng)面的愈合情況并運用ELISA方法測量感染前、感染后2 d以及治療后第3、6、9天大鼠皮膚肌肉標本中FGFs的含量。結果χ2檢驗顯示四組的有效率差異有統(tǒng)計學意義(t=50.48，P＜0.05)，臭氧水組的有效率最高(70%)，臭氧組其次(50%)，但優(yōu)于洗必泰組(30%)和對照組(10%)。除感染前外，各個干預組的FGFs含量均與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時治療后第3、6天臭氧水組的FGFs含量[(124.05±7.94)μg/kg，(179.02±14.95)μg/kg]明顯高于臭氧組[(78.98±7.22)μg/kg，(112.97±12.66)μg/kg]和洗必泰組[(54.86±6.38)μg/kg，(56.03±7.8)μg/kg]，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.737、2.893、3.022，2.907，均P＜0.05)，在治療后第9天，臭氧組的FGFs含量[(263.79±40.09)μg/kg]與臭氧水組[(260.12±28.9)μg/kg]比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.023，P＞0.05)。結論臭氧和臭氧水均是高效消毒劑，均能夠通過提高皮膚肌肉組織中FGFs的含量促使創(chuàng)面的愈合，但臭氧水要優(yōu)于臭氧。

臭氧；臭氧水；FGFs；創(chuàng)面愈合

隨著生活科技技術的現(xiàn)代化進程，高能量創(chuàng)傷的發(fā)病率逐年上升，由此導致的感染性創(chuàng)面的發(fā)生率也逐年增加，據(jù)統(tǒng)計約有25%的傷員需要較長時間的傷口和創(chuàng)面處理[1]。最近幾年，感染性創(chuàng)面的臭氧治療越來越受到各國醫(yī)學工作者的青睞，原因在于其簡單、安全、創(chuàng)傷小、費用低[2]。以往的研究主要集中在臭氧氣體的作用，很少見臭氧水處理感染性創(chuàng)面的相關報道。但是有研究發(fā)現(xiàn)臭氧溶于水后同樣具有強大的氧化作用[3]，因此2012-2013年筆者設計本研究選擇成纖維細胞生長因子(FGFs)作為觀察指標，從分子生物學角度探討臭氧水對感染性創(chuàng)面的修復作用，報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Vista大鼠40只(雌雄鼠分別20只)，體質量(200±15)g，大鼠符合Ⅰ級清潔動物的等級標準。

1.2 實驗設備 臭氧發(fā)生器、日本OLYMPUS CHB-213照相顯微鏡、光學顯微鏡。

1.3 實驗制劑及材料 雙蒸水、金黃色葡萄球菌(菌液濃度＞20億/ml)、新型止血海綿(由湛江衛(wèi)生材料廠提供)、EGF試劑盒(96/48人份酶標板、塑料膜板蓋、生物素標記的抗EGF抗體、親和鏈酶素一HRP)、磁力攪拌棒、加樣器。

1.4 實驗方法

1.4.1 臭氧水制備 將二次蒸餾水倒入臭氧消毒劑生成機(采用武漢市康橋電子消毒設備廠研制的“260型臭氧消毒治療機”)的儲水槽中(容量約2 500 ml)，室溫20℃，制取10 mg/L、20 mg/L的臭氧水，用于創(chuàng)面的清洗和消毒[2]。

1.4.2 動物分組 40只Vista大鼠按換藥方式的不同隨機分為四組：洗必泰治療組、臭氧組、臭氧水組、對照組，每組各10只，稱重標記(飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在26℃，室內濕度70%，保持室內良好通風狀態(tài))。

1.4.3 建造實驗模型 將Vista大鼠適應性喂養(yǎng)1周，實驗前1 d將各組大鼠脊背和左側大腿處脫毛備皮，乙醚麻醉，獲得大鼠4～5 cm背部裸露皮膚的模型，消毒后沿脊柱右側全層切開皮膚可以深達筋膜的線型切口長約3 cm，開放創(chuàng)口，常規(guī)止血后，在傷口處均勻涂抹菌液濃度＞20億/ml的金黃色葡萄球菌，使實驗大鼠形成感染創(chuàng)面。所有大鼠均按上述方法造模，手術時間大約持續(xù)5 h[3]。

1.4.4 給藥方法及標本采集 各組模型感染成功后按照預先分組制定的實驗要求第2天開始用藥，每天一次，9 d為一個療程，在治療前、治療后3 d、6 d、9 d分別對感染傷口的變化進行觀察，評價創(chuàng)面愈合情況，抽取靜脈血檢查白細胞計數(shù)，切取皮膚、肌肉組織標本進行光鏡病例分析。各組均于感染前、感染后2 d、治療后第3、6、9天分別取切口皮膚、肌肉組織標本(零下70℃保存)，用Elisa法測量FGFs的含量。

1.4.5 觀察指標 (1)創(chuàng)面愈合情況。評價標準[4]分為四級：①非常明顯：切口完全愈合或切口稍有紅腫但無滲出，不影響愈合；②較明顯：切口基本愈合，局部(＜1 cm)愈合欠佳但無滲出；③不明顯：切口部分愈合(＜1 cm)，未愈合部分有紅腫滲出；④無：感染切口較治療前無變化甚至惡化。有效率(%)=非常明顯+較明顯/總例數(shù)×100%。(2)檢測大鼠肌肉皮膚中FGFS含量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，創(chuàng)面愈合情況以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，F(xiàn)GFs含量以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 感染創(chuàng)面愈合情況 感染2 d后，所有實驗觀察大鼠創(chuàng)面均出現(xiàn)了炎癥反應，表面有炎性滲出物。實施了不同的干預措施后，χ2檢驗顯示四組的有效率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=50.48，P＜0.05)，臭氧水組的有效率最好(70%)，臭氧組其次(50%)，但優(yōu)于洗必泰組(30%)和對照組(10%)。

表1 各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況[只（%）]

2.2 FGFS含量變化 通過單因素方差分析，除感染前外，各個干預組的FGFs含量均與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時治療后第3、6天臭氧水組的FGFs含量明顯高于臭氧組和洗必泰組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.737、2.893、3.022，2.907，均P＜0.05)，在治療后第9天，臭氧組的FGFs含量與臭氧水組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.023，P＞0.05)，見表2。

表2 大鼠FGFs在不同觀察期的含量變化(±s)

表2 大鼠FGFs在不同觀察期的含量變化(±s)

組別FGFs(μg/kg)臭氧水組(n=10)臭氧組(n=10)洗必泰組(n=10)對照組(n=10) F值P值感染前43.04±4.78 43.91±4.12 45.01±3.97 45.01±2.49 1.682＞0.05感染后2 d 73.06±10.65 57.08±5.68 49.07±3.41 50.03±3.48 24.993＜0.05治療后3 d 124.05±7.94 78.98±7.22 54.86±6.38 49.08±1.97 35.01＜0.05治療后6 d 179.02±14.95 112.97±12.66 56.03±7.8 44.98±2.43 55.44＜0.05治療后9 d 263.79±40.09 260.12±28.9 56.99±6.99 42.96±3.35 49.98＜0.05

3 討 論

醫(yī)用臭氧(Medical ozone，02-03)是利用醫(yī)用純氧制備的臭氧與純氧的混合氣體，具有較強的氧化作用，能通過氧化還原作用迅速殺滅細菌，為廣譜有效的強殺菌劑[5]。隨著對醫(yī)用臭氧的生物藥學特性認識的深入研究，臭氧在醫(yī)療界中被廣泛應用，在歐洲等地醫(yī)用臭氧廣泛用于治療糖尿病足、創(chuàng)傷及皮膚潰瘍的愈合、腦中風、潰瘍性結腸炎、關節(jié)炎、椎間盤突出癥等疾病，其臨床療效得到了充分肯定[6]。

通過氧化作用破壞微生物細胞膜從而實現(xiàn)殺菌是臭氧殺菌的重要機理。研究發(fā)現(xiàn)濕度和溫度的提高有利于加強臭氧的消毒作用，當臭氧溶解到水中會有更強勁的殺菌消毒和分解催化作用，能把有機物、重金屬分解或轉化為對人體無害的物質[7]。臭氧水殺菌的廣譜性使之能夠在短時間內有效殺滅金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、流感病毒等多種微生物，具備高效的殺菌速率[8]。同時，臭氧水殺菌產生的活性氧可以維持人體正常呼吸，促進創(chuàng)面的愈合[9]。利用該類物質殺菌可以很好的避免使用抗生素帶來的不良反應，具有無痛苦、起效快的優(yōu)點。臭氧具有強氧化性與不穩(wěn)定性，在常溫常壓空氣中易還原為氧氣(半衰期45 min)。臭氧可溶于水，在常溫常壓下臭氧在水中的溶解度比氧高約13倍，比空氣高25倍。但臭氧在水中的分解速度比空氣中快的多。如水中臭氧濃度為6.25×105mol/L(3 mg/L)時，其半衰期為5～30 min，但在純水中分解速度較慢，如在蒸餾水或自來水中的半衰期大約是20 min(20℃)，然而在二次蒸餾水中，經過85 min后臭氧分解只有10%，若水溫接近0℃時，臭氧會變得更加穩(wěn)定。因此本研究采用二次蒸餾水制備臭氧水[10]。

成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)是一種多肽，能促進成纖維細胞有絲分裂、中胚層細胞的生長，還可刺激血管形成，在創(chuàng)傷愈合及肢體再生中發(fā)揮作用[11]。部分國內外研究顯示，F(xiàn)GFs參與調控創(chuàng)傷修復的全過程，巨噬細胞、血小板以及內皮細胞是其主要來源，而淋巴細胞、成纖維細胞和上皮細胞也可以生成FGFs[12]。Plichta等[13]報道免疫細胞之間相互調控促使創(chuàng)面的愈合，該類調控十分精確，是通過FGFs等活性生物分子的釋放實現(xiàn)的。Narita等[14]研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面形成后數(shù)小時后會出現(xiàn)炎癥反應，為抵御細菌的負面作用，巨噬細胞會攻擊微生物并分泌多種細胞生長因子如FGFs等。目前，關于在創(chuàng)面愈合的過程中出現(xiàn)FGFs的大量分泌和積累，促使創(chuàng)面愈合的理論已獲得共識，本研究正是利用這一理論通過觀測FGFs在不同干預組的變化情況來分析臭氧水和臭氧以及洗必泰治療的不同功效。研究結果顯示，在治療大鼠感染性創(chuàng)面方面臭氧水和臭氧的有效率明顯優(yōu)于洗必泰治療和對照組，同時臭氧水的方法又優(yōu)于臭氧組，治療后第3、6天臭氧水組實驗大鼠皮膚和肌肉中FGFs含量明顯高于其他三組，但治療后第9天臭氧水組合臭氧組FGFs含量差異無統(tǒng)計學意義；說明臭氧和臭氧水增加了創(chuàng)面FGFs的含量，從而促進細胞分裂增殖，以達到傷口愈合的目的，并且臭氧水的效果要優(yōu)于臭氧。

綜上所述，臭氧水可促進感染性創(chuàng)面的修復，其效果優(yōu)于臭氧和洗必泰，值得臨床推廣應用。

[1]Kerstein MD.The physiology of wound healing[M].Pennsylvama: Allegheny University of the Health Sciences,1998:21-23．

[2]黃華軍.臭氧水對感染性創(chuàng)面抗炎修復作用的初步實驗研究[D].南方醫(yī)科大學.

[3]竇群立,劉 波,楊 鋒,等.創(chuàng)復康噴劑對切線傷模型SD大鼠創(chuàng)傷修復中bFGF及TGF-β1的影響[J].甘肅中醫(yī),2009,22(7): 69-70.

[4]何曉峰.臭氧治療的臨床應用[M].北京:科學出版社，2009:9-11.

[5]王正國.創(chuàng)傷修復的分子生物學研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2000, 6(16):36-327.

[6]Bennett NT,Schultz GS.Growth factors and wound healing.PartⅡ. Role in normal and chronic wound healing[J].Am J Surg,1993, 166:74-81.

[7]吳杭慶,王良喜,孫 勇,等.臭氧水在深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面治療及抗感染中的作用[J].江蘇醫(yī)藥,2010,36(2):148-150.

[8]張桂祥,林修光.臭氧水穩(wěn)定性與殺菌性的試驗觀察[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2007,34(9):1772-1773.

[9]Guven A,Gundogdu G,Sadir S,et al.The efficacy of ozone therapy in experimental caustic esophageal burn[J].J Pediatr Surg,2008,43 (9):1679-1684.

[10]彭 程,賀全勇,彭 浩.燒傷創(chuàng)面膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡的研究[J].實用醫(yī)學雜志,2009,25(14):2223-2225.

[11]Dise RS,Frey MR,Whitehead RH,et al.Epidermal growth factor timulates Rac activation thromgh Src and phosphatidylinositol 3-kinase to promote colonic epithelial cell migragation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008,294(1):276-285.

[12]Madej P,Plewka A,Madej JA,et al.Ozone therapy in induced endotoxemic shock.II.The effect of ozone therapy upon selected histochemical reactions in organs of rats in endotoxemic shock[J].Inflammation,2007,30(3-4):69-86.

[13]Plichta JK,Radek KA.Sugar-coating woundrepair:a review of FGF-10 and dermatan sulfate in wound healingand their potential application in burn wounds[J].J Burn Care Res,2012,6(3): 299-310.

[14]Narita A,Takahara M,Sato D,et al.Biodegradable gelatin hydrogels incorporating fibroblast growth factor 2 promote healing of horizontal tears in rabbit meniscus[J].Arthroscopy,2012,28(2): 255-263.

Molecular biology study on the effects of ozone and ozone water in repairing the infective wounds.

LI Yun-kai1,CHEN Li-yan2,WANG Hui3,QIU Si-qiang1.1.The Fifth Surgical Department,The Fourth People's Hospital of Jinan, Jinan 250031,Shandong,CHINA;2.Nursing Department,Fourth People's Hospital of Jinan,Jinan 250031,Shandong, CHINA;3.The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jinan,Jinan 250012,Shandong,CHINA

Objective To explore the effects of ozone and ozone water in repairing the infective wounds by using molecular biology methods.Methods40 vista rats with infective wounds were randomly divided into 4 groups according to different ways of changing the dressing:chlorhexidine treatment group(n=10),ozone group(n=10),ozone water group(n=10)and the control group(n=10).The reparations of the infective wounds of rats in each group were observed and evaluated 9 days after the dressings changing and the FGFs from skin and muscle specimens of all rats in different groups were detected before the treatment,48h after infection and the 3rd,6th and 9th day of treatment by ELISA.Resultsχ2test showed the difference of effective rate between each group was significantly important(χ2=50.48，P＜0.05).The effective rate of ozone water group was the highest(70%)and that of ozone group was the second(50%) higher than that of chlorhexidine group(30%)and control group(10%).The values of FGFs in treatment groups were significantly higher than that of control group except for the values before the infection.Meanwhile,the values of FGFs on the 3rd and the 6th day of treatment in ozone water group(124.05±7.94)μg/kg,(179.02±14.95)μg/kg were higher than that of ozone group(78.98±7.22)μg/kg,(112.97±12.66)μg/kg and that of chlorhexidine group(54.86±6.38)μg/kg, (56.03±7.8)μg/kg,and the differences were statistically significant(t=2.737、2.893、3.022,2.907,P＜0.05).On the 9thday after treatment,the difference of FGFs value between ozone water group[(263.79±40.09)μg/kg]and ozone group [(260.12±28.9)μg/kg]was not significantly important(t=-1.023,P＞0.05).ConclusionOzone and Ozone water were both effective disinfectant,they could contribute to the wound healing by improving the FGFS level in skin and muscle tissue.However,the recovery effect of ozone water was better than that of ozone.

Ozone;Ozone water;FGFs;Wound healing

R-332

A

1003—6350(2014)10—1409—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.10.0545

2013-11-22)

濟南市科技發(fā)展計劃項目（編號：201121063）

李云愷。E-mail：byzhanshi@126.com