羥基磷灰石涂層鎂鋁合金的體外生物相容性研究

陳旭瓊，尹慶水，夏 虹，吳增暉，王智運(yùn)，艾福志，王建華

基礎(chǔ)研究

羥基磷灰石涂層鎂鋁合金的體外生物相容性研究

陳旭瓊，尹慶水，夏 虹，吳增暉，王智運(yùn)，艾福志，王建華

目的評價羥基磷灰石（HA）涂層鎂鋁合金（AZ31B）的體外生物相容性。方法實驗分為3組：HA涂層AZ31B浸提液組（H組）、陽性對照組（P組）和空白對照組（N組）。將L929細(xì)胞與各組混合液培養(yǎng)3、5和7 d，采用WST-1法檢測細(xì)胞活力并進(jìn)行細(xì)胞毒性分級。各組混合液與稀釋兔血混勻，測定吸光度（OD）并計算溶血率。采用各組混合液對白化豚鼠分別進(jìn)行皮內(nèi)誘導(dǎo)、局部誘導(dǎo)和激發(fā)，觀察去除貼敷片24、48、72 h動物激發(fā)部位皮膚情況。結(jié)果3、5和7 d N組和H組細(xì)胞毒性反應(yīng)分級為0級，P組部分細(xì)胞毒性反應(yīng)分級為3級；各時間點H組、N組細(xì)胞活力均高于P組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。H組、P組和N組OD值分別為（0.004± 0.001）、（0.648±0.050）和（0.008±0.003）；H組溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。去除貼敷片24、48、72 h H組皮膚無明顯改變，P組可見中度至重度融合性紅斑。結(jié)論體外實驗提示HA涂層鎂鋁合金具有良好的體外生物相容性。

鎂；鋁；合金；羥基磷灰石類；骨代用品；生物相容性材料；組織相容性實驗；體外研究

大部分骨科手術(shù)患者需要進(jìn)行內(nèi)固定來穩(wěn)定骨折，以達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的。目前臨床應(yīng)用的內(nèi)固定材料主要為鉻鎳不銹鋼、鈷合金、鈦合金等傳統(tǒng)金屬，最大的弊端是術(shù)后需二次手術(shù)取出[1]。鎂合金具有與人體相匹配的力學(xué)特性，以及其它金屬所不具有的可降解性，可望成為一種新型骨科植入材料[2-3]。但鎂合金本身降解太快，無法直接應(yīng)用于人體。鎂鋁合金可在增強(qiáng)鎂金屬力學(xué)強(qiáng)度的同時減少其降解速率[4-6]；羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）涂層則可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步保護(hù)鎂鋁合金不被快速降解，但生物相容性如何，相關(guān)報道不多。本研究對HA涂層鎂鋁合金進(jìn)行體外生物安全性評價，為該材料在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和材料

酶標(biāo)儀（澳大利亞，Biocell公司），Du530分光光度計(美國，Beckman公司)；CO2培養(yǎng)箱（美國，Thermo Scientific公司）；高糖DMEM培養(yǎng)液、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶（美國，Hyclone公司），WST-1（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），草酸鉀（廣州化學(xué)試劑廠），二甲基亞砜（DMSO）、完全氟氏佐劑（美國，Sigma公司）；HA涂層鎂鋁合金（AZ31B）圓盤型樣品，直徑10 mm、厚3 mm（中國科學(xué)院金屬所提供）；小鼠成纖維細(xì)胞L929（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科細(xì)胞庫提供）。

1.2 實驗動物

新鮮抗凝兔血取自新西蘭大白兔[廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，SCXK（粵）2008-0002]，白化豚鼠購自廣東省實驗動物中心[SCXK（粵）2008-0002]。

1.3 細(xì)胞毒性實驗

將傳代培養(yǎng)良好的L929細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為104/mL。各取100 μL稀釋后的含細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。共54個孔，分為3組，每組分為3個觀察期（即細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d），各組每一觀察期平行6孔。

將AZ31B浸泡于2 mL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h。AZ31B組（H組）加入含血清DMEM培養(yǎng)液的AZ31B浸提液；陽性對照組（P組）加入5%DMSO的含血清DMEM培養(yǎng)液（即DMSO與含細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為1∶20）；空白對照組（N組）加入含血清DMEM培養(yǎng)液。24 h后各組分別取100 μL浸提液，加入含細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)板中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2、4、6 d各孔分別加入50 μL含血清DMEM培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞生存生長獲得持續(xù)的營養(yǎng)。

分別于培養(yǎng)3、5、7 d取各組6孔觀察細(xì)胞形態(tài)，按細(xì)胞毒性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）判定毒性分級。培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入10 μL WST-1溶液后置于搖床上搖動1 min，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀在420和620 nm下測量吸光度（optical density，OD）值，檢測細(xì)胞活力。

1.4 溶血實驗

實驗分為HA涂層AZ31B浸提液實驗組（H組）、蒸餾水陽性對照組（P組）以及生理鹽水陰性對照組（N組）。各組平行操作3個樣本。其中H組將HA涂層AZ31B樣品完全浸泡于生理鹽水（濃度為0.9%）中，37℃恒慍水浴保持30 min。取0.1 mL草酸鉀溶液（濃度為20 g/L）加入干燥管中。

取新西蘭白大白兔血2 mL加入干燥管，2.5 mL生理鹽水（濃度為0.9%）稀釋。AZ31B浸提液、蒸餾水、生理鹽水（各2 mL）中分別加入0.02 mL稀釋兔血，混勻后37℃水浴繼續(xù)保溫60 min，取出后以1 000 r/min離心5 min。比色皿中移入各組上清液，分光光度計于545 nm波長處測定OD值。

實驗樣品溶血率按以下公式計算：實驗樣品溶血率=（實驗組OD值—陰性對照組OD值）/（陽性對照組OD值—陰性對照組OD值）。陰性對照組的OD值不應(yīng)大于0.03，陽性對照組的OD值應(yīng)在0.5～1.0之間。

1.5 最大劑量致敏實驗

白化豚鼠共30只，體重250～350 g，雌雄不限。隨機(jī)分為3組，陰性和陽性對照組各8只，實驗組14只。HA涂層AZ31B浸提液組為實驗組（H組），陽性對照為5%甲醛溶液組（P組），陰性對照為生理鹽水組（N組）。

1.5.1 浸提液制備 實驗組取14個HA涂層AZ31B樣品，浸泡于2.0 mL生理鹽水（濃度為0.9%）中，37℃恒溫水浴浸提24 h。

1.5.2 溶液制備 A液：完全氟氏佐劑與生理鹽水以1∶1體積比混合；B液：HA涂層AZ31B浸提液、5%甲醛和生理鹽水，分別對應(yīng)H組、P組及N組；C液：將B液和A液以1∶1體積比混合。

1.5.3 皮內(nèi)誘導(dǎo)階段 實驗前一天剔除白化豚鼠頸背部（兩側(cè)肩胛骨內(nèi)側(cè)）鼠毛，面積約40 mm× 50 mm。實驗第一天在去毛區(qū)中線兩側(cè)劃3個對稱點，從頭到尾分別為對稱的a、b、c點，兩側(cè)點間距15 mm，頭尾點之間間距25 mm，各組取0.1 mL A、B、C液分別注射于a、b、c點。

1.5.4 局部誘導(dǎo)階段 實驗第六天，將10%十二烷基硫酸鈉按摩導(dǎo)入原去毛區(qū)皮膚；第七天將25 mm ×30 mm醫(yī)用一次性中單的粗糙面浸透B液后貼敷于每只白化豚鼠原去毛區(qū)的誘導(dǎo)注射點，纏繞固定，48 h后除去包扎帶和貼敷片。

1.5.5 激發(fā)階段 實驗第二十天，剔除豚鼠右上腹部被毛，范圍40 mm×60 mm；第二十一天將25 mm ×30 mm醫(yī)用一次性中單粗糙面浸透C液后貼敷于豚鼠腹部去毛區(qū)，纏繞固定，24 h后去除。

激發(fā)階段除去貼敷片后24 h、48 h、72 h觀察各組動物激發(fā)部位皮膚情況，以出現(xiàn)紅斑表示有致敏反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組細(xì)胞毒性實驗OD值的比較采用Factorial ANOVA分析，組間兩兩比較采用S-N-K法；多組溶血試驗OD值的比較采用One-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實驗

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)觀察期（×200）1A H組培養(yǎng)3 d 1B P組培養(yǎng)3 d 1C N組培養(yǎng)3 d 1D H組培養(yǎng)5 d 1E P組培養(yǎng)5 d 1F N組培養(yǎng)5 d 1G H組培養(yǎng)7 d 1H P組培養(yǎng)7 d 1I N組培養(yǎng)7 d注：H組：加入含血清DMEM培養(yǎng)液的AZ31B浸提液組；P組：加入5%DMSO含血清DMEM培養(yǎng)液的陽性對照組；N組：加入含血清DMEM培養(yǎng)液的空白對照組

如圖1所示，培養(yǎng)3、5、7 d N組和H組細(xì)胞貼壁生長良好，無細(xì)胞懸浮，毒性反應(yīng)分級為0級；P組部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞量較少，毒性反應(yīng)分級為3級。N組和H組培養(yǎng)3 d細(xì)胞密度較低，細(xì)胞伸展良好，呈長梭形或多邊形；培養(yǎng)5 d細(xì)胞密度增加，細(xì)胞間較為擁擠，絕大部分細(xì)胞伸展良好，呈長梭形或多邊形，部分細(xì)胞因細(xì)胞密度增加而形成圓形；培養(yǎng)7 d細(xì)胞密度極高，細(xì)胞間極其擁擠，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，細(xì)胞難以伸展，細(xì)胞形態(tài)變小，出現(xiàn)大量圓形細(xì)胞。

如表2所示，H組和N組各觀察期OD值均較P組為高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H組和N組隨時間推移細(xì)胞活力逐漸增大，5 d時達(dá)到最高峰后開始下降（P＜0.05）。

2.2 溶血試驗

如表3所示，N組、P組平均OD值分別為（0.008±0.003）和（0.648±0.050），本組實驗有效；H組溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。

2.3 最大劑量致敏實驗

如圖2所示，H組和N組去除貼敷片后24、48、72 h皮膚未見明顯改變，P組可見中度至重度融合性紅斑。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)不同時相點OD值比較（±s，n=6）

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)不同時相點OD值比較（±s，n=6）

注：OD：光密度；H組：加入含血清DMEM培養(yǎng)液的AZ31B浸提液組；P組：加入5%DMSO含血清DMEM培養(yǎng)液的陽性對照組；N組：加入含血清DMEM培養(yǎng)液的空白對照組。*與同一時間點P組比較，P＜0.05；#與同一組3 d比較，P＜0.05；@與同一組5 d比較，P＜0.05

組別H組P組N組平均值F值P值3 d 1.097±0.089* 0.292±0.010 1.317±0.042* 0.902±0.013 535.916 0.000 5 d 1.379±0.067*# 0.270±0.015 1.622±0.156*# 1.090±0.023 322.111 0.000 7 d 0.845±0.068*@ 0.281±0.006 0.995±0.070*@ 0.707±0.013 266.738 0.000平均值1.107±0.018 0.281±0.003 1.311±0.241 0.900±0.495 122.753 0.000 F值75.452 5.815 56.853 995.387 F=296.096 P=0.000 P值0.000 0.014 0.000 0.000

表3 溶血試驗各組OD值和溶血率（±s，n=3）

表3 溶血試驗各組OD值和溶血率（±s，n=3）

注：OD：光密度；H組：AZ31B浸提液實驗組；P組：蒸餾水陽性對照組；N組：生理鹽水陰性對照組；*與P組比較，P＜0.05

分組H組P組N組F值P值OD值0.004±0.001* 0.648±0.050 0.008±0.003* 487.781 0.000溶血率/%—0.6 100.0 0- -

3 討論

為解決傳統(tǒng)骨科植入物需二次取出或長期殘留體內(nèi)的弊端，人們致力于開發(fā)一種新型骨科植入材料，其應(yīng)該具備的條件包括：①初始力學(xué)強(qiáng)度足以支撐病變部位的受力，與骨組織具有良好的力學(xué)相容性；②可適當(dāng)降解；③降解過程所產(chǎn)生的離子對機(jī)體無不良影響，具有無毒、無過敏性、無致癌性的特點；④盡可能減少并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險[7-8]。鎂合金是目前研究較多的金屬材料，其主要缺點是低耐蝕性，生理環(huán)境下的快速腐蝕是其成為骨科植入材料的最大障礙[9]。因此，提高鎂合金的耐蝕性能，是目前鎂合金材料學(xué)研究的一個方向。

中科院金屬所研制的AZ31B鎂鋁合金成分為3%Al，1%Zn，其余為Mg；擠壓后抗拉強(qiáng)度為280 MPa，延伸率為20%，彈性模量為45 GPa，具有良好的力學(xué)特性。目前的研究表明，對合金進(jìn)行保護(hù)性涂層和表面處理，可以提高材料的抗腐蝕性，并增強(qiáng)材料的生物相容性和鎂基植入物的生理活性[10-13]。人工HA材料的組成性質(zhì)與人體組織HA極為相似，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)作用，可為新骨形成提供支架[14]。劉魁等[15]的研究結(jié)果表明，與AZ31B比較，HA涂層的AZ31B材料生物安全性明顯增加，溶血率降低，抗腐蝕性能增強(qiáng)。我們的研究結(jié)果顯示，HA涂層的鎂鋁合金與L929細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d后，浸提液內(nèi)細(xì)胞貼壁生長良好，無細(xì)胞懸浮，毒性反應(yīng)為0級，OD值亦明顯高于陽性對照組（P＜0.05）。這些結(jié)果均提示該合金材料無細(xì)胞毒性。

我們還觀察到，HA涂層鎂鋁合金與L929細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d，細(xì)胞活力隨時間推移，一開始呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，5 d達(dá)到最大活力，隨后開始下降，這一隨時間變化的趨勢與陰性對照組相似。原因可能是，一開始兩組細(xì)胞在培養(yǎng)孔中密度適中，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)足以為細(xì)胞生長提供充分的養(yǎng)料，因此細(xì)胞活力能隨時間推移而增加；5 d后，兩組細(xì)胞在培養(yǎng)孔中密度增加，細(xì)胞相對擁擠，加入的培養(yǎng)液已無法滿足培養(yǎng)孔中細(xì)胞營養(yǎng)的需求，細(xì)胞無法完全伸展，細(xì)胞形態(tài)變小、變圓，進(jìn)而影響了細(xì)胞的活力。這種現(xiàn)象并非是HA涂層鎂鋁合金的毒性表現(xiàn)，而是該材料良好細(xì)胞相容性的佐證。陽性對照組細(xì)胞活力隨時間變化并未出現(xiàn)明顯改變，表明細(xì)胞生長始終處于受抑制狀態(tài)。

圖2 激發(fā)階段去除貼敷片后白化豚鼠皮膚反應(yīng)圖片 2A H組去除貼敷片后24 h 2B P組去除貼敷片后24 h 2C N組去除貼敷片后24 h 2D H組去除貼敷片后48 h 2E P組去除貼敷片后48 h 2F N組去除貼敷片后48 h 2G H組去除貼敷片后72 h 2H P組去除貼敷片后72 h 2I N組去除貼敷片后72 h注：H組：AZ31B浸提液實驗組：P組：5%甲醛溶液陽性對照組；N組：生理鹽水陰性對照組

我們既往的實驗研究結(jié)果證實，無涂層鎂鋁合金具有嚴(yán)重的溶血反應(yīng)[16]，本實驗結(jié)果顯示，HA涂層鎂鋁合金溶血率為—0.6%，無溶血反應(yīng)。孟祥翔等[17]報道，表面進(jìn)行階躍式陽極氧化改性后的鎂合金(AZ-1和AZ-3)材料溶血率＜5%，具有良好的血液相容性；郭磊等[18]對氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料進(jìn)行安全性評價，結(jié)果顯示，與AZ31B鎂材料較高的溶血率相比，經(jīng)氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料其溶血率符合生物材料標(biāo)準(zhǔn)，表明涂層處理可大大減少鎂合金的溶血作用。

盡管我們的既往研究[19]提示鎂鋁合金無皮膚致敏作用，但畢竟涂層改變了鎂鋁合金的性狀，因此我們對HA涂層鎂鋁合金作了進(jìn)一步的皮膚致敏實驗，結(jié)果顯示豚鼠皮膚無明顯改變，該涂層材料無致敏作用。

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Biocompatibility of magnesium-aluminum alloy with hydroxyapatite coating in vitro

CHEN Xuqiong,YIN Qingshui,XIA Hong,WU Zenghui,WANG Zhiyun,AI Fuzhi,WANG Jianhua.Hospital of Orthopaedics,Guangzhou Gerneral Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou,Guangdong 510010,China

YIN Qingshui,E-mail:gz_yqs@126.com

ObjectiveTo evaluate the biocompatibility of magnesium-aluminum alloy(AZ31B)with hydroxyapatite (HA) coating in vitro.Methods The experimentincluded three groups,group of HA-coated AZ31B leaching liquors(H group),positive control group(P group)and blank group(N group).L929 cells were cultured with mixtures in 3 groups for 3,5 and 7 days,the cell toxicity was graded,and cell viability was measured by WST-1.Optical density(OD)was examined and hemolysis rate was then calculated after diluted cony blood mixed with mixtures in each group.Intradermally,locally induction and stimulation were underwent on the skin of Cavia Cobaya with mixtures in 3 groups.The condition of skin sensitization of Cavia Cobaya was observed 24,48 and 72 h after sticking removed.Results Cell toxicity was graded as 0 grade in Hgroup and N group after 3,5 and 7 day's culture,while the cell toxicity of part of cells in P group was graded as 3 grade.Cell viability in H and N groups were higher than that in P group,the difference had statistical significance(P＞0.05).OD in H group,P group and N groups was(0.004±0.001),(0.648±0.050)and(0.008 ±0.003)respectively.The rate of haemolysis was—0.6%in H group,and no hemolysis reaction was found.The skin had no obvious changes in H group 24,48 and 72 h after sticking removed,while moderate to severe cofluenterythema on the skin was found in P group.Conclusion Experimentalresults showed magnesium-aluminum alloy with HA coating has good biocompatibility in vitro.

Megnesium;Aluminum;Alloys;Hydroxyapatites;Bone substitutes;Biocompatible materials; Histocompatibility testing;In vitro

R318.08，R329.2

A

1674-666X（2014）03-0159-07

2014-03-28；

2014-05-14）

（本文編輯：白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2014.03.006

國家自然科學(xué)基金資助（30872642），全軍“十二五”計劃課題重點項目（BWS11C065）

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院

尹慶水，E-mail：gz_yqs@126.com