自組裝金片表面化學(xué)功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附的影響

鄧英虎，李麗華，李 梅，夏 虹

基礎(chǔ)研究

自組裝金片表面化學(xué)功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附的影響

鄧英虎，李麗華，李 梅，夏 虹

目的探討自組裝金片表面化學(xué)功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附的影響。方法將標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的金片，放入帶有1%不同功能團(tuán)的硫醇試劑中浸泡12 h，自組裝為甲基、氨基、羧基和羥基功能團(tuán)的單一表面膜，并對其表面接觸角進(jìn)行測定。將U2-OS細(xì)胞接種于不同功能團(tuán)及對照組（裸金片）表面，培養(yǎng)3、6、9 h后，光鏡下觀察各組細(xì)胞黏附數(shù)及形態(tài)學(xué)變化，選擇培養(yǎng)6 h的金片進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果羥基、羧基、氨基和甲基表面接觸角為9.5°±1.2°、18.3°±3.9°、59.7°±3.8°和105°±9.1°，不同化學(xué)基團(tuán)修飾表面的接觸角比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)3 h，各組黏附于金片表面的細(xì)胞基本呈小圓形，甲基表面黏附的細(xì)胞不緊密，呈將脫落狀；培養(yǎng)6 h，氨基、羧基、羥基及對照組金片表面細(xì)胞體積增大，可見大橢圓形、梭形及多邊形細(xì)胞，而在甲基組金片表面細(xì)胞仍呈小圓形；培養(yǎng)9 h，各組細(xì)胞形態(tài)變化差異更加明顯，而甲基表面的細(xì)胞多數(shù)仍呈圓形或橢圓形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，甲基金片表面的細(xì)胞數(shù)增加最不明顯，不同時(shí)相點(diǎn)各組細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組金片表面黏附細(xì)胞數(shù)總體趨勢為甲基<<羥基<羧基≈氨基。掃描電鏡下細(xì)胞在羥基和羧基表面多為橢圓形和多邊形，細(xì)胞體積較大，胞漿豐富，可見較多偽足伸出，部分較大偽足相互融合；氨基表面細(xì)胞多數(shù)為長梭形；甲基表面的細(xì)胞仍呈小圓形，細(xì)胞體積較小。結(jié)論甲基功能團(tuán)可能對自組裝金片表面骨肉瘤細(xì)胞的黏附行為具有抑制作用。

骨肉瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；細(xì)胞黏附；自組裝膜；化學(xué)功能團(tuán)

隨著組織工程學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展，有關(guān)材料表面細(xì)胞黏附行為的研究越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。而甲基、羥基、氨基、羧基等功能團(tuán)不僅對神經(jīng)干細(xì)胞[1]、間充質(zhì)干細(xì)胞[2-3]等正常組織細(xì)胞的黏附造成影響，而且還會改變材料對肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的黏附能力[4-5]。本研究觀察自組裝金片單一規(guī)律化學(xué)功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附行為的影響，試圖尋找出有效抑制骨肉瘤細(xì)胞黏附的化學(xué)功能團(tuán)，為今后制備抑瘤型人工假體材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

頭基分別為甲基、氨基、羧基和羥基的4種硫醇（美國Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），硅片、OCA20接觸角測量系統(tǒng)（德國Dataphysics公司），S-3700N掃描電鏡（日本Hitachi公司），HBOSO/AC光學(xué)顯微鏡（德國Zeiss公司），AIRTECH超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司），TY-80s搖床（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Precision Scientific公司），HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀（北京海德生物公司），SC-7自動噴金儀（美國Pelco公司）。

1.2 金片制備

采用真空蒸鍍或等離子濺射方法在硅（110）光滑面上鍍一層Ti，然后在Ti層上鍍一層厚約10 nm的金制備鍍金硅片，取回后切割成相應(yīng)24孔板大小的形狀，面積為0.8 cm×1.2 cm，于蒸餾水中清洗3次，濃硫酸和雙氧水3∶1混合溶液中浸泡10 min，無水乙醇清洗，再用蒸餾水清洗，置于小皿中保存。

1.3 金片表面不同化學(xué)功能團(tuán)的接種

將帶有1%不同功能團(tuán)濃度的硫醇溶液加入小皿中浸泡金片，以封口膠帶封口、錫箔紙包裝后全程避光，浸泡12 h。此間硫醇分子與金片表面發(fā)生共價(jià)結(jié)合，自行組裝于金片表面，最后將這些表面分別帶有甲基、羥基、氨基和羧基功能團(tuán)的金片放入24孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)細(xì)胞前以滅菌的PBS反復(fù)浸洗5次。

1.4 不同化學(xué)功能團(tuán)的接觸角測量

本項(xiàng)目委托清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系再生與仿生材料研究所完成。首先用氮?dú)夂娓山又玫臉悠?，然后在每種化學(xué)官能團(tuán)材料表面滴4 mL超純水。使用接觸角測量系統(tǒng)在大氣環(huán)境下分別測量4種化學(xué)官能團(tuán)材料表面的接觸角，每次3個(gè)標(biāo)本，每種化學(xué)功能團(tuán)共重復(fù)測量6次。

1.5 骨肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

骨肉瘤細(xì)胞株由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科細(xì)胞庫提供。從液氮罐中取出U2-OS細(xì)胞盒，經(jīng)快速復(fù)蘇、平衡離心后用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸管反復(fù)吹打細(xì)胞至濃度為5×105/mL的單細(xì)胞懸液。分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入2～3 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，待細(xì)胞完全貼壁生長后換液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞幾乎布滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.6 光鏡觀察U2-OS細(xì)胞黏附情況

將接種有4種不同功能團(tuán)的金片放入24孔板中，含甲基組、氨基組、羥基組和羧基組功能團(tuán)金片各3孔，每孔1片金片，裸金片作為對照組。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為1×104/mL的單細(xì)胞懸液，每孔250μL，再加入250μL培養(yǎng)液成等比例稀釋，輕輕吹打，避免細(xì)胞因加液過程中的重力作用而堆積于金片表面，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3、6、9 h，光鏡下觀察各組細(xì)胞黏附情況，200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 掃描電鏡觀察U2-OS細(xì)胞黏附形態(tài)

將接種有4種不同功能團(tuán)的金片放入24孔板中，含甲基、氨基、羥基和羧基功能團(tuán)金片各3孔，每孔1片金片，裸金片作為對照組。呈對數(shù)生長期的U2-OS細(xì)胞消化、離心和稀釋后通過含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)稀釋為1×104/mL的單細(xì)胞懸液，每孔250μL，再加入250μL培養(yǎng)液成等比例稀釋，輕輕吹打，置入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，吸凈各孔培養(yǎng)基，每孔加入3%戊二醛溶液250μL，封口于4℃下靜置30 min；PBS洗4次，每次15 min；30%、50%乙醇每個(gè)濃度依次脫水2次，每次10 min；70%乙醇脫水15 min或置于70%乙醇中保存過夜；90%乙醇脫水5 min；無水乙醇脫水2次，每次5 min；無水丙酮脫水5 min；乙酸異戊酯置換2次，每次5 min；HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀干燥3 h，黏樣品上銅臺，自動噴金儀鍍金，最后經(jīng)掃描電鏡觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組比較采用One-WayANOVA分析，不同時(shí)相點(diǎn)的表面黏附細(xì)胞數(shù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析法（General Linear Model法）進(jìn)行比較，方差齊時(shí)組間多重比較采用LSD-t法，方差不齊時(shí)采用Welch法和Dunnetts T3法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)功能團(tuán)表面接觸角

鍍金硅片與不同的硫醇試劑反應(yīng)后，分別得到表面結(jié)構(gòu)均勻的單分子自組裝膜，這種單分子膜的表面分別為單一的甲基、氨基、羧基和羥基化學(xué)功能團(tuán)。羥基化、羧基化、氨基化、甲基化化學(xué)基團(tuán)表面的接觸角分別為9.5°±1.2°、18.3°± 3.9°、59.7°±3.8°和105°±9.1°；不同化學(xué)基團(tuán)修飾表面的接觸角比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（W= 1 488.411，P=0.000）。

2.2光鏡下細(xì)胞黏附情況

培養(yǎng)3 h，各組黏附于金片表面的細(xì)胞基本呈小圓形，少許呈小橢圓形，甲基表面黏附的細(xì)胞不緊密，呈將脫落狀；培養(yǎng)6 h，各組細(xì)胞形態(tài)開始多樣化，氨基、羧基、羥基及對照組金片表面細(xì)胞體積增大，可見大橢圓形、梭形及多邊形細(xì)胞，而在甲基表面細(xì)胞仍呈小圓形；培養(yǎng)9 h，各組細(xì)胞形態(tài)變化差異更加明顯，有更多梭形、不規(guī)則形細(xì)胞出現(xiàn)，而甲基表面的細(xì)胞多數(shù)仍呈圓形或橢圓形，梭形、不規(guī)則形細(xì)胞較少。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，甲基組細(xì)胞數(shù)增加最不明顯，羥基組和對照組細(xì)胞數(shù)增長較少，氨基和羧基組細(xì)胞數(shù)明顯增加，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果不拒絕球形假設(shè)（W=0.813，P=0.394），且檢測時(shí)間點(diǎn)與組間有交互作用（F=89.315，P=0.000），不同時(shí)相點(diǎn)各組細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 122.008，P=0.000）。見圖1，表1。

具體來說，培養(yǎng)3 h黏附細(xì)胞以氨基組金片表面稍多，甲基組、羥基組和對照組表面較少（圖2）。氨基組與甲基組、羥基組和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與羧基組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；甲基組、羥基組和對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖3所示，培養(yǎng)6 h甲基表面細(xì)胞數(shù)增加不明顯，其他各組表面細(xì)胞數(shù)均有不同程度增加，氨基組增加最明顯，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而甲基組與對照組表面細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖4所示，培養(yǎng)9 h氨基組、羧基組和羥基組細(xì)胞數(shù)均明顯增多，其中氨基組增加最明顯，甲基組增加不明顯，各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組金片表面黏附細(xì)胞數(shù)均數(shù)總體趨勢為甲基<<羥基<羧基≈氨基。

圖1 不同時(shí)相各組功能團(tuán)表面細(xì)胞數(shù)

表1 不同化學(xué)功能團(tuán)表面黏附細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=3，個(gè)）

表1 不同化學(xué)功能團(tuán)表面黏附細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=3，個(gè)）

時(shí)相點(diǎn)組別F值P值甲基組氨基組羥基組羧基組對照組F值P值3 h 20.3±1.5 24.7±1.5 21.7±1.5 24.3±1.2 21.7±1.5 4.969 0.018 6 h 20.3±1.5 40.33±2.5 27.7±1.5 35.7±2.5 23.3±1.5 53.542 0.000 9 h 23.0±1.7 64.3±4.0 45.0±2.0 56.3±1.5 40.0±2.0 127.483 0.000 64.000 219.939 193.366 184.623 74.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001 ----

2.3 掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附形態(tài)

掃描電鏡下各組功能團(tuán)表面黏附細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化如圖5所示，U2-OS細(xì)胞與各組金片混合培養(yǎng)6 h，細(xì)胞在羥基和羧基組金片表面多呈橢圓形和多邊形，細(xì)胞體積較大，胞漿豐富，可見較多偽足伸出，部分較大偽足相互融合；而氨基功能團(tuán)表面的細(xì)胞多數(shù)為長梭形；甲基表面的細(xì)胞仍呈小圓形，細(xì)胞體積較小。

圖2 U2-OS細(xì)胞在不同化學(xué)功能團(tuán)表面培養(yǎng)3 h鏡下觀察（200×）2A甲基 2B氨基2C羥基 2D羧基 2E對照組

圖3 U2-OS細(xì)胞在不同化學(xué)功能團(tuán)表面培養(yǎng)6 h鏡下觀察（200×）3A甲基 3B氨基3C羥基 3D羧基 3E對照組

3 討論

骨肉瘤屬于間葉組織來源的惡性腫瘤，目前尚缺乏行之有效的治療方案。隨著新輔助化療技術(shù)的開展，保肢手術(shù)成為主要的外科治療方式，但仍面臨著局部腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤切除后骨與軟組織重建等問題。抗腫瘤人工骨移植材料的研制是目前的一個(gè)發(fā)展方向[6-7]。從這個(gè)角度出發(fā)，如果將具有抗骨肉瘤細(xì)胞黏附的化學(xué)功能團(tuán)用于骨移植材料或假體的表面修飾，達(dá)到局部應(yīng)用時(shí)降低骨肉瘤細(xì)胞黏附、增殖，甚至誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡、壞死的作用，就能夠起到治療或降低骨肉瘤復(fù)發(fā)的效果。自組裝膜是利用固體表面在稀溶液中吸附活性物質(zhì)而形成的有序分子，金片自組裝膜具有金表面穩(wěn)定、S-Au鍵強(qiáng)度高、反應(yīng)條件易控制以及單分子膜高度有序均勻等特點(diǎn)，可排除材料表面其他各種生物物理因素的干擾，有利于考察材料單一化學(xué)因素對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[8-10]。有鑒于此，我們采用自組裝膜技術(shù)，觀察自組裝金片表面化學(xué)功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附的影響，以期篩選出適合用于抑瘤型人工骨移植材料的化學(xué)功能團(tuán)。

圖4 U2-OS細(xì)胞在不同化學(xué)功能團(tuán)表面培養(yǎng)9 h鏡下觀察（200×）4A甲基 4B氨基4C羥基 4D羧基 4E對照組

3.1 細(xì)胞黏附性能的影響因素

骨肉瘤細(xì)胞在不同化學(xué)功能團(tuán)表面黏附異?？赡苁艿蕉喾N因素影響，如化學(xué)功能團(tuán)的親疏水性[11-12]、細(xì)胞黏附蛋白和黏附分子[13-15]和化學(xué)功能團(tuán)表面的流剪切應(yīng)力[16-17]等。

Ren等[1]報(bào)道，甲基具有非常強(qiáng)的疏水性，而羥基、羧基均具有親水性，其中羥基親水性較強(qiáng)；甲基組的神經(jīng)干細(xì)胞與材料表面接觸面積最小，細(xì)胞最圓，在甲基、羧基表面細(xì)胞則有長的突起形成。Barrias等[12]的觀測結(jié)果表明，不同的羥基和甲基組成，其接觸角各不相同。本研究結(jié)果顯示，甲基、羥基、羧基和氨基具有不同的親疏水性，其中羥基、羧基和氨基的表面接觸角均＜90°，提示三者均存在親水性，其中羥基表面接觸角最小，最具親水性；羧基表面的接觸角稍大，親水性居中；氨基表面的接觸角進(jìn)一步增大，親水性降低，相對具有疏水性，但仍屬于親水基團(tuán)；而甲基表面的接觸角最大，具有最強(qiáng)的疏水性。

化學(xué)功能團(tuán)表面吸附的黏附蛋白和細(xì)胞表面黏附分子的共同作用也會直接影響細(xì)胞在材料表面的黏附。Faucheux等[18]發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇和羥基組表面吸附的血清蛋白明顯少于氨基、甲基和羧基表面，且主要吸附的蛋白成分為玻連蛋白，很少檢測到纖連蛋白；甲基和氨基、羧基表面吸附的血清蛋白相似，但甲基表面的成纖維細(xì)胞數(shù)明顯少于羧基和氨基組，可能是由于氨基和羧基可以提高細(xì)胞表面的整合素家族活性，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞在氨基和羧基表面的黏附。Keselowsky等[19]的研究結(jié)果同樣證實(shí)，細(xì)胞與材料的黏附過程主要受α5β1整合素受體調(diào)控，羥基團(tuán)能吸附大量有利于黏附的蛋白成分，氨基和羧基具有中等程度的蛋白吸附能力，而甲基吸附蛋白的能力最弱。

亦有學(xué)者探討不同化學(xué)功能團(tuán)表面流剪切應(yīng)力對細(xì)胞黏附行為的影響。Tegoulia等[16]發(fā)現(xiàn)甲基、羧基、磷酰膽堿、氧化乙烯和羥基功能團(tuán)表面的剪切速率不同，剪切速率越大，細(xì)胞的黏附情況越差。Li等[17]的研究結(jié)果則顯示，氨基擴(kuò)大了細(xì)胞對流剪切應(yīng)力的反應(yīng)，而甲基和羥基則作用相反。

圖5 掃描電鏡觀察培養(yǎng)6 h各組化學(xué)功能團(tuán)表面黏附細(xì)胞形態(tài) 5A甲基 5B氨基 5C羥基 5D羧基

3.2 自組裝膜表面功能團(tuán)對骨肉瘤細(xì)胞黏附影響

骨肉瘤細(xì)胞具有貼壁生長的生物學(xué)特性，同樣存在吸附、接觸、貼壁和擴(kuò)展等4個(gè)基本過程。本研究結(jié)果表明，在氨基、羥基和羧基表面，骨肉瘤細(xì)胞也同樣具有良好的黏附性及擴(kuò)展能力，這與之前其它細(xì)胞的相關(guān)研究報(bào)道一致[4-5]。然而，在甲基表面黏附的骨肉瘤細(xì)胞呈小圓形，體積非常小，黏附的細(xì)胞數(shù)也較少。一方面可能與甲基功能團(tuán)具有較強(qiáng)的疏水性，不利于細(xì)胞的黏附有關(guān)；另一方面甲基化學(xué)功能團(tuán)可能抑制了整合素家族的活性，阻止了黏附蛋白的有效吸附。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)在羥基和羧基表面的細(xì)胞早期呈現(xiàn)出多邊形態(tài)，氨基表面的細(xì)胞形態(tài)更加多樣化，主要為長梭形和多邊形，提示氨基表面的細(xì)胞活性可能高于羥基和羧基；各組細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長均呈現(xiàn)增加趨勢，表明化學(xué)功能團(tuán)隨著時(shí)間的延長可能存在一定程度的衰減或脫落可能。

然而，骨肉瘤細(xì)胞在甲基、氨基、羧基和羥基表面黏附的多樣性需要從多角度進(jìn)行分析。如果簡單從化學(xué)功能團(tuán)的親水特性來分析，羥基具有最強(qiáng)的親水性，甲基具有最強(qiáng)的疏水性，甲基表面黏附的細(xì)胞數(shù)應(yīng)該最少，羥基表面最多；如果按照Keselowsky等[19]的整合素受體調(diào)控機(jī)制來分析，同樣也是羥基組細(xì)胞數(shù)最多，甲基組細(xì)胞數(shù)最少。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示，氨基和羧基組表面黏附的骨肉瘤細(xì)胞數(shù)最多。究其原因，我們認(rèn)為細(xì)胞在材料表面的黏附情況是非常復(fù)雜的，可能有多種作用機(jī)制存在，既要考慮材料的親水性，又要考慮材料的化學(xué)特性和流剪切應(yīng)力等，同時(shí)細(xì)胞自身不同的生物學(xué)特性也可能影響細(xì)胞黏附的過程。

綜上所述，甲基功能團(tuán)具有較強(qiáng)的抑制骨肉瘤細(xì)胞黏附的作用，下一步我們將深入研究其在抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡過程中所扮演的角色，以期為骨肉瘤的治療選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Ren YJ,Zhang H,Huang H,et al.In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups[J].Biomaterials,2009,30(6):1036-1044.

[2]Curran JM,Chen R,Hunt JA.Controlling the phenotype and function of mesenchymal stem cells in vitro by adhesion to silane-modified clean glass surfaces[J].Biomaterials,2005, 26(34):7057-7067.

[3]Bauer S,Park J,von der Mark K,et al.Improved attachment of mesenchymal stem cells on super-hydrophobic TiO2 nanotubes[J].Acta Biomater,2008,4(5):1576-1582.

[4]Yan H,Zhang S,He J,et al.Self-assembled monolayers with different chemical group substrates for the study of MCF-7 breast cancer cell line behavior[J].Biomed Mater,2013,8 (3):035008.

[5]Yu XL,Xu SJ,Shao JD,et al.Different fate of cancer cells on several chemical functional groups[J].Surface Coating Technol,2013,228(Suppl 1):S48-S54.

[6]楊進(jìn)城,張余,尹慶水.自制抗腫瘤珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及性能評價(jià)[J].廣東醫(yī)醫(yī)學(xué),2010,31(24):3160-3163.

[7]馮偉,靳安民,劉紀(jì)恩,等.5-氟尿嘧啶納米微球復(fù)合材料填充骨缺損及抗腫瘤作用[J].中國組織工程,2013,17(12): 2131-2137.

[8]Smith RK,Lewis PA,Weiss PS.Patterning self-assembled monolayers[J].Prog Surf Sci,2004,75(1-2):1-68.

[9] Poirier GE,Pylant ED.The self-assembly mechanism of alkanethiols on Au(111)[J].Science,1996,272(5265): 1145-1148.

[10]Thevenot P,Cho J,Wavhal D,et al.Surface chemistry influences cancer killing effect of TiO2 nanoparticles[J]. Nanomedicine,2008,4(3):226-236.

[11]Wijenayaka AK,Colby CB,Atkins GJ,et al.Biomimetic hydroxyapatite coating on glass coverslips for the assay of osteoclast activity in vitro[J].J Mater Sci Mater Med,2009, 20(7):1467-1473.

[12]Barrias CC,Martins MC,Almeida-Porada G,et al.The correlation between the adsorption of adhesive proteins and cellbehaviouron hydroxyl-methylmixed self-assembled monolayers[J].Biomaterials,2009,30(3):307-316.

[13]Lee J,Choi I,Yeo WS.Preparation of gradient surfaces by using a simple chemical reaction and investigation of cell adhesion on a two-component gradient[J].Chemistry,2013, 19(18):5609-5616.

[14]Yoon SH,Mofrad MR.Cell adhesion and detachment on gold surfaces modified with a thiol-functionalized RGD peptide [J].Biomaterials,2011,32(30):7286-7296.

[15]Kim DJ,Lee JM,Park JG,et al.A self-assembled monolayer-based micropatterned array for controlling cell adhesion and protein adsorption[J].Biotechnol Bioeng,2011,108(5): 1194-1202.

[16]Tegoulia VA,Cooper SL.Leukocyte adhesion on model surfaces under flow:effects of surface chemistry,protein adsorption,and shear rate[J].J Biomed Mater Res,2000,50 (3):291-301.

[17]Li Y,Luo YF,Huang K,et al.The responses of osteoblasts to fluid shear stress depend on substrate chemistries[J]. Archives of Biochem Biophys,2013,539(1):38-50.

[18]Faucheux N,Schweiss R,Lützow K,et al.Self-assembled monolayerswith differentterminating groupsasmodel substrates for cell adhesion studies[J].Biomaterials,2004,25 (14):2721-2730.

[19]Keselowsky BG,Collard DM,García AJ.Surface chemistry modulates focal adhesion composition and signaling through changes in integrin binding[J].Biomaterials,2004,25(28): 5947-5954.

Effects of chemical groups of gold surface with self-assembled monolayers on osteosarcoma cells adhesion

DENG Yinghu*,LI Lihua,LI Mei,XIA Hong.*Department II of Orthopaedics,Tongling People's Hospital, Tongling,Anhui 244000,China.

XIA Hong,E-mail:gzxiahong2@126.com

ObjectiveTo observe the effects of chemical groups of gold surface with self-assembled monolayers(SAMs)on U2-OS sarcoma cells adhesion.Methods After immersion into thiol solutions with 1%different chemical groups for 12 h respectively,the methyl(-CH3),amino(-NH2),carboxyl(-COOH)and hydroxyl(-OH)functional groups were self-assembled on Au layers,and the surface contact angles were determined respectively to evaluate the equivalent surface densities of chemical functional groups.U2-OS cells were seeded on these substrates,and the surface of bare Au layers was as control.Cell adhesion was observed under light microscope after 3,6,9 hours'culture,and further examination was undertaken by scanning electron microscopy(SEM)after 6 hours'culture.Results The contact angle of-OH,-COOH,-NH2 and-CH3 surface was 9.5°±1.2°,18.3°±3.9°,59.7°±3.8°and 105°±9.1°respectively,which there had statistical differences among these chemical groups(P＜0.05).Under light microscope,after 3 hours'culture,almost all of U2-OS cells adhered onto the surface of the gold subtrates began to present a small round shape,the cells on the-CH3 surface seemed to be very loose.Six hours later,cells volume on the surface of-NH2,-COOH,-OH and control group increased,and large oval,polygonal,spindle cells had been found,but the cells on-CH3 surface were still small round.After 9 hours'incubation,there existed significant differences of cell morphology in different groups,while cells on-CH3 surface still remained round or oval.As the culture time went by,cell number increase on-CH3 surface was the least,the differences of cell number among groups at each time point had statisticalsignificance (P ＜0.05);The adhesion numberofU2-OS cellsfollowed the trend:-CH3< <-OH<-COOH≈-NH2.SEM results indicated that U2-OS cells cultured on-OH and-COOH surfaces after 6 hours'incubation often exhibited polygonal and oval morphology with bigger volume and adbundant cytoplasm, and more pseudopodia extended and partial fused with each other;Most of cells on-NH2 surface showed a spindle shape,while cells cultured on-CH3 surface were smaller and in a spherical shape.Conclusion-CH3 functional group probably inhibit the adhesion of osteosarcoma cells on the gold surface with SAMs.

Osteosarcoma;Tumorcells,cultured;Celladhesion;Chemicalfunctionalgroup; Self-assembled monolayer

R738，R361.3

A

1674-666X（2014）04-0238-08

2014-05-10；

2014-06-13）

（本文編輯：張 輝）

10.3969/j.issn.1674-666X.2014.04.008

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81272057）；全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十二五計(jì)劃”（81271957）

244000安徽，銅陵市人民醫(yī)院骨2科（鄧英虎）；510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院（李麗華，李梅，夏虹）

夏虹，E-mail：gzxiahong2@126.com