黃豆醬中低聚肽的分離及抗氧化活性研究

阮長(zhǎng)青 劉肇明

RUAN Chang－qing 1，2 LIU Zhao－ming 1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，黑龍江 大慶 163319）

（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

黃豆醬亦稱大豆醬，是以大豆和面粉為主要原料，通過微生物發(fā)酵釀制而成的一種半流動(dòng)狀態(tài)的調(diào)味品［1，2］。在發(fā)酵過程中由于微生物酶系的作用，會(huì)發(fā)生復(fù)雜的變化，形成豆醬特有的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)地。與此同時(shí)大分子的蛋白也有一部分被分解成小分子的肽段［3］。這些被分解而成的小肽不僅利于人體吸收而且還有許多肽具有多種生物活性，其中包括抗氧化活性、降血壓活性（ACE抑制肽）、降膽固醇活性、降血脂、抑菌、抗病毒等等［4－6］。目前相關(guān)國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)主要集中在從大豆水解液中分離純化抗氧化肽，曹亞蘭等［7］從大豆水解液中分離并測(cè)定 出 Leu－Tyr－His－Thr，Ser－Phe－Val三段具有抗氧化活性的肽段，而基于大豆天然發(fā)酵產(chǎn)物分離純化抗氧化肽并測(cè)得序列的研究相對(duì)匱乏。關(guān)晴等［8］利用葡聚糖凝膠柱從黃豆醬中分離得4個(gè)抗氧化肽峰譜圖，但未測(cè)定活性肽的分子量分布且所獲產(chǎn)品未達(dá)到測(cè)序的要求純度。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，利用膜分離、柱分離等手段找到具有較強(qiáng)抗氧化活性的低聚肽并確定其分子量分布及抗氧化性質(zhì)，為進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系、吸收機(jī)制等研究提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆醬：黑龍江省寶泉嶺農(nóng)墾寶泉醬業(yè)有限公司；

活性炭粉末：天津市大茂化學(xué)試劑廠；

DEAE瓊脂糖凝膠樹脂：西安交大保賽生物技術(shù)股份有限公司；

葡聚糖凝膠G－15：上海西寶生物科技有限公司；

ABTS試劑盒、羥自由基試劑盒、超氧陰離子自由基：南京建成生物工程研究所有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)：CR3i multifunction型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

層析住（帶轉(zhuǎn)換接頭）：#1.5$50 cm，上海廈美生化科技發(fā)展有限公司；

普通層析?。?1.6×100 cm，上海煊盛生化科技有限公司；

冷凍干燥機(jī)：ALPHA1－2 LD型，德國(guó)Christ公司；

紫外檢測(cè)器：HD－3型，上海滬西分析儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：SPECORD210plus型，德國(guó) Analytikjena公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃豆醬的脫色及膜分離工藝 采用水法提取黃豆醬肽，通過預(yù)試驗(yàn)獲得最佳提取條件為料液比1∶11.9（m∶m），提取溫度56℃，溶液p H 6.0，提取時(shí)間61 min。采用活性炭法脫色，活性炭用量6%，脫色溫度35℃，脫色時(shí)間40 min，溶液p H 5.0，對(duì)脫色液進(jìn)行膜分離，收集分子量在3 000 Da以下的部分凍干用于進(jìn)一步分離并測(cè)定其抗氧化活性［8］。

1.3.2 黃豆醬低聚肽的DEAE（二乙氨基乙醇）瓊脂糖凝膠分離 用50 g DEAE瓊脂糖凝膠作為填料灌裝#1.5×50 cm層析柱（帶轉(zhuǎn)換接頭），將收集的3 000 Da以下凍干粉用緩沖溶液配成一定濃度的溶液上樣，采用NaCl的Tris—HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)分離情況確定緩沖液的最佳p H并對(duì)各個(gè)峰的活性進(jìn)行測(cè)定，收集活性最高峰凍干制粉用于下一步分離。

1.3.3 DEAEQ瓊脂糖凝膠分離后各組分活性研究 評(píng)價(jià)抗氧化活性肽的指標(biāo)為羥自由基清除率、銅離子清除率、超氧陰離子清除率和ABTS抗氧化活性的測(cè)定。

1.3.4 黃豆醬低聚肽的G－15葡聚糖凝膠分離 采用G－15葡聚糖凝膠灌裝#1.6×100 cm普通層析柱（膠面距上液面距離小于5 cm）將上步試驗(yàn)收集的高活性峰的凍干粉配制成一定濃度的溶液上樣，按分離情況確定其最佳上樣濃度，最佳流速。對(duì)分離的峰進(jìn)行活性測(cè)定，并收集活性最高峰。

1.3.5 黃豆醬抗氧化肽分子量測(cè)定 凝膠過濾層析技術(shù)可分離分子量大小不同的蛋白質(zhì)并可粗略的估計(jì)其分子量的大小。Sephadex G－15最適分離范圍是700～1 500 Da，適用于脫鹽、肽與其它小分子的分離。對(duì)分子量大于1 500 Da的物質(zhì)其洗脫液體積（Ve）與外水體積（V o）相等。

1.3.6 黃豆醬肽抗氧化活性的測(cè)定方法 采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃豆醬低聚肽DEAE瓊脂糖凝膠分離的最佳p H

采用p H 為7.8，8.2，8.6的Tris—HCl緩沖液溶把樣品配成50 mg／m L的溶液并上樣，上樣體積為3 m L，洗脫速度為2 m L／min根據(jù)分離情況確定緩沖液的最佳p H。分離情況見圖1。

DEAE為陰離子樹脂，故所采用的緩沖液p H最好在多肽的等電點(diǎn)附近，使多肽間作用力減弱，易于沉降，此時(shí)多肽與離子樹脂發(fā)生離子交換的可能性增強(qiáng)，再用相同p H梯度濃度的NaCl去洗脫樹脂，根據(jù)離子濃度不同可獲得不同極性的肽段，達(dá)到較好的分離效果。由圖1可知，黃豆醬樣品在p H 為7.8時(shí)只在0.1 mol／L與0.4 mol／L的 NaCl洗脫液洗脫時(shí)出峰，分離效果不明顯，可能是p H過小，負(fù)電荷化不夠強(qiáng)，交換吸附不明顯。在p H為8.2時(shí)黃豆醬肽洗脫出3個(gè)峰，而在p H為8.6時(shí)可以洗脫出4個(gè)峰，分離效果相對(duì)較好，故選用p H為8.6的緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行處理。

圖1 不同p H緩沖液黃豆醬肽紫外吸收曲線Figure 1 Different p H purification soybean paste peptide

2.2 DEAE瓊脂糖凝膠分離后各組分抗氧化活性分析結(jié)果

分別對(duì)經(jīng)DEAE樹脂分離的4個(gè)峰進(jìn)行收集并凍干，分別測(cè)定其抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子能力、銅離子還原能力和ABTS清除能力，結(jié)果見表1。其中0.1 mol／L的NaCl洗脫出的峰F1活性最高，收集凍干，應(yīng)用分子篩進(jìn)一步分離。

表1 DEAE瓊脂糖凝膠分離后各組分抗氧化指標(biāo)Table 1 The antioxidant activity of different constituents

2.3 Sephadex G－15凝膠分離最佳上樣濃度確定結(jié)果

在凝膠分離中樣品的濃度也對(duì)分析效果有重要影響，在分析型凝膠過濾中，樣品的濃度、帶電性質(zhì)對(duì)分離效果均產(chǎn)生影響［9］。結(jié)合圖2的分離情況可知，在上樣濃度為1.2 mg／m L時(shí)分離效果最好。

圖2 不同濃度黃豆醬肽的純化吸收峰曲線Figure 2 Different concentrations of purification soybean paste peptide

2.4 Sephadex G－15凝膠分離最佳流速選擇

對(duì)于凝膠柱分離不同分子量的肽段，最佳流速的選擇因分子量大小不同而存在差異，低流速時(shí)，大分子肽段傳質(zhì)時(shí)間長(zhǎng)，洗脫分離效果明顯，小分子肽段容易發(fā)生縱向擴(kuò)散，分離不夠明顯，而高流速下則正相反［10］。結(jié)合圖3可知，使用Sephadex G－15分離黃豆醬肽時(shí)最佳流速應(yīng)為2 mL／min。

2.5 各部分肽段的分子量測(cè)定結(jié)果

將已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品VB12、Angiotensin（高血壓肽）和還原型谷胱甘肽分別配成一定濃度的溶液，經(jīng)針式微孔膜過濾后上樣，上樣量為3.0 m L。各標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量、分子量的對(duì)數(shù)及保留管數(shù)列于表2中，以保留管數(shù)為橫座標(biāo)，分別以吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)品分子量對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)作圖，見圖4。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程，計(jì)算黃豆醬肽經(jīng)葡聚糖凝膠分段后各段分子量范圍為1 124～1 659，925～1 124，580～925，408～580 Da。

2.6 分離各組分活性結(jié)果

經(jīng)DEAE瓊脂糖凝膠分離得到的F1活性最強(qiáng)，通過Sephadex G－15凝膠分離所得4個(gè)峰分別測(cè)其抗氧化指標(biāo)，結(jié)果見表3。

綜合分析各峰抗氧化能力可知，F(xiàn)1－2與F1－3的活性相當(dāng)，F(xiàn)1－1與F1－4的活性較弱，應(yīng)選 F1－2、F1－3進(jìn)行進(jìn)一步分離研究。

圖3 不同洗脫流速純化黃豆醬肽的吸收峰曲線Figure 3 Flow rate of purification soybean paste peptide

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量與保留管數(shù)Table 2 The molecular weight and elution pipe number

圖4 黃豆醬肽段分子量分布圖Figure 4 Different moleculair weight of soybean paste peptide

3 結(jié)論

采用黃豆醬為原料，利用超濾分離、色譜分離技術(shù)找到了一種研究黃豆醬中低聚肽抗氧化性質(zhì)的方法，并確定了高抗氧化活性組分的分子量分布。最佳工藝參數(shù)：DEAE離子交換樹脂處理黃豆醬肽的最佳p H為8.6，葡聚糖凝膠G－15分離最佳流速為2 m L／min，上樣濃度為1.2 mg／m L，并確定了高抗氧化活性的兩組黃豆醬低聚肽分子量范圍為925～1 124，580～925 Da，為黃豆醬肽進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系、吸收機(jī)制等研究提供了方法。

表3 經(jīng)Sephadex G－15純化后黃豆醬肽各組分抗氧化測(cè)定結(jié)果Table 3 The antioxidant activity of purification soybean paste peptide

1 劉穎，劉婧美，王佳瑞，等.傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬高β－葡萄糖苷酶活力制曲工藝研究［J］.食品與機(jī)械，2009，25（6）：134～137.

2 趙建新，顧小紅，劉楊岷，等.傳統(tǒng)豆醬揮發(fā)性風(fēng)味化合物的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（12）：684～687.

3 孫常雁，孔保華.自然發(fā)酵黃豆醬中主要微生物酶系的形成及作用［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

4 Beermann C，Euler M，Herzberg J，et al.Anti－oxidative capacity of enzymatically released peptides from soybean protein isolate［J］.Food Research and Technology，2009，229（4）：637～644.

5 王層飛，李忠海，龔吉軍，等.生物活性肽的保健功能及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究［J］.食品與機(jī)械，2008，24（3）：128～131.

6 Sarmadi B H，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins：a review［J］.Peptides，2010，31（10）：1 949～1 956.

7 曹亞蘭，趙謀明.大豆抗氧化肽的制備、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2012.

8 關(guān)晴，阮長(zhǎng)青.黃豆醬中水溶性肽的提取及抗氧化活性研究［D］.大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2012.

9 田亞平.生化分離技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：85～87.

10 田亞平，周楠迪.生化分離原理與技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：62～84.