NSCLC組織中nm-23和VEGF蛋白的表達(dá)及其臨床意義

陽諾，馬輝，冼磊，陳銘伍，郭建極，胡松

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科1、肝腸外科2，廣西 南寧 530021)

·論著·

NSCLC組織中nm-23和VEGF蛋白的表達(dá)及其臨床意義

陽諾1，馬輝2，冼磊1，陳銘伍1，郭建極1，胡松1

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科1、肝腸外科2，廣西 南寧 530021)

目的探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中nm-23和VEGF蛋白的表達(dá)情況及其臨床意義。方法通過免疫組化和組織芯片技術(shù)，分別檢測(cè)208例NSCLC患者腫瘤組織、150例癌旁組織及17例良性疾病肺組織中nm-23和VEGF蛋白的表達(dá)狀況。結(jié)果①NSCLC癌組織中nm-23蛋白的表達(dá)程度顯著高于癌旁組織及良性肺疾病組織(P<0.001)；nm-23蛋白表達(dá)程度與NSCL的C臨床分期、分化程度相關(guān)(P<0.05)。②NSCLC癌組織中VEGF蛋白表達(dá)程度顯著高于癌旁組織及良性肺疾病組織(P<0.001)；VEGF蛋白表達(dá)程度與NSCLC分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論①NSCLC腫瘤組織中nm-23及VEGF蛋白均呈高表達(dá)，提示兩者與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；②NSCLC的臨床分期及分化程度與nm-23蛋白表達(dá)程度相關(guān)，NSCLC的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否與VEGF蛋白表達(dá)的程度相關(guān)，提示兩者均與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

組織芯片；免疫組化；nm-23；VEGF；非小細(xì)胞肺癌

nm-23是近年研究較多的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因之一，但關(guān)于nm-23蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的關(guān)系尚不明確。此外，NSCLC的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有賴于血管生長(zhǎng)，但關(guān)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)與NSCLC的關(guān)系同樣尚不明確。本研究通過應(yīng)用組織芯片、免疫組化技術(shù)，檢測(cè)nm-23和VEGF蛋白在NSCLC中的表達(dá)情況，以期探討其與NSCLC的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源采集我院2001年4月至2008年7月共208例NSCLC標(biāo)本。所有患者術(shù)前無放、化療，為初治，均行肺癌根治術(shù)，有病理診斷。其中，男性144例，女性64例；年齡35～84歲；腺癌126例，鱗癌69例，其他13例；中高分化124例，低分化84例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移129例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期129例，Ⅲ、Ⅳ期79例。150例NSCLC患者同期取癌旁組織檢測(cè)。此外，選取17例經(jīng)手術(shù)治療的良性肺疾病患者為對(duì)照，其中男性11例，女性6例，年齡20～69歲。以上標(biāo)本均以福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片經(jīng)HE染色及SP法免疫組化染色，顯微鏡下明確診斷。

1.2 主要儀器、試劑nm-23及VEGF免疫組化試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。組織陣列儀由美國(guó)Beecher Instruments公司生產(chǎn)。去除DNA和RNA酶的載玻片產(chǎn)自德國(guó)Menzel Glaser公司，在多聚賴氨酸溶液中浸泡包被1 min，45℃烤箱內(nèi)烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 制作組織芯片采用108點(diǎn)(12×9)的長(zhǎng)方形陣列圖，36例NSCLC組織每例取2點(diǎn)，36例癌旁組織每例取1點(diǎn)，合計(jì)108點(diǎn)，癌旁組織不足的用正常組織替代。選取HE切片標(biāo)本中的腫瘤集中區(qū)域，在對(duì)應(yīng)蠟塊的相應(yīng)位置做標(biāo)記。按49:1的比例將德國(guó)萊卡蠟和美國(guó)進(jìn)口蠟混合，經(jīng)3次沉淀去除雜質(zhì)，制成受體蠟塊。在受體蠟塊上按設(shè)計(jì)好的陣列圖應(yīng)用陣列儀打孔(直徑、間距及深度均為2 mm)，從供體蠟塊上提取選定的組織注入受體蠟塊相應(yīng)部位，重復(fù)該步驟直至108點(diǎn)均有組織芯。將芯片蠟塊含組織面倒放于干凈的載玻片上，37℃恒溫箱放置15 min后取出，載玻片輕壓蠟塊，使含組織的一面保持平整；蠟塊50℃過夜，使組織芯和受體蠟塊進(jìn)一步融合；自然恢復(fù)室溫后，4℃過夜；然后3～4 μm切片，控制水溫45℃左右撈片；將切片58℃過夜，用于后期實(shí)驗(yàn)。切片裱于玻片上，蠟封，4℃保存。

1.3.2 染色及判定結(jié)果SP法行免疫組化染色。一抗為nm-23免疫組化試劑盒及VEGF免疫組化試劑盒，良性肺疾病肺組織為對(duì)照。胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比：陰性為<10%，陽性為>10%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,其中兩樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)，多樣本率的比較采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片蠟塊本實(shí)驗(yàn)共制作6個(gè)組織芯片蠟塊，效果良好。

2.2 NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及良性肺疾病肺組織中nm-23、VEGF的蛋白表達(dá)情況nm-23蛋白在208例NSCLC腫瘤組織中呈陽性表達(dá)161例，150例癌旁組織中呈陽性表達(dá)11例，17例良性肺疾病肺組織中呈陽性表達(dá)1例。其中，nm-23蛋白在腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=69.246，P<0.05)；在腫瘤組織與良性肺疾病肺組織中的表達(dá)情況同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.224，P<0.05)；但在癌旁組織與良性肺疾病肺組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。VEGF蛋白在208例NSCLC腫瘤組織中呈陽性表達(dá)113例，150例癌旁組織中呈陽性表達(dá)2例，17例良性肺疾病肺組織中呈陽性表達(dá)0例。其中VEGF蛋白在腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 64.371，P<0.05)；在腫瘤組織與良性肺疾病肺組織中的表達(dá)情況同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.990，P< 0.05)；但在癌旁組織與良性肺疾病肺組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。

2.3 nm-23、VEGF蛋白與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系nm-23的蛋白表達(dá)與NSCLC的臨床分期及分化程度相關(guān)(P<0.05)，VEGF的蛋白表達(dá)與NSCLC的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 nm-23與VEGF與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

2.4 nm-23與VEGF的相關(guān)性nm-23與VEGF在NSCLC組織中兩者均表達(dá)陽性93例，均表達(dá)陰性7例，nm-23表達(dá)陽性而VEGF表達(dá)陰性68例，VEGF表達(dá)陽性而nm-23表達(dá)陰性20例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)性分析，χ2=2.565<3.84，P>0.05，提示兩基因表達(dá)之間不存在相關(guān)性。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是多基因共同作用所致，且基因與蛋白產(chǎn)物之間相互作用、彼此調(diào)控，因此腫瘤中基因的異常表達(dá)及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相互關(guān)系是目前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。

nm-23基因是一個(gè)多功能基因，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控、分化抑制、信號(hào)傳導(dǎo)、微管組裝相關(guān)，同時(shí)與癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。不少研究證實(shí)在人或動(dòng)物的某些實(shí)體癌中存在nm-23基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，因此認(rèn)為nm-23基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，但確切機(jī)制尚不清楚。目前，肺癌中關(guān)于nm-23基因在抑制肺癌轉(zhuǎn)移方面的作用，結(jié)論各家報(bào)道不一，其中有不少研究認(rèn)為nm-23基因與腫瘤分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[1-2]，但也有研究認(rèn)為nm-23基因的表達(dá)是獨(dú)立的臨床病理學(xué)因素,與患者的腫瘤分期、大小、分化程度、淋巴結(jié)受侵襲狀態(tài)及預(yù)后均無明顯關(guān)系。本研究表明，nm-23的蛋白表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、病理類型和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與臨床分期及分化程度有關(guān)，與國(guó)內(nèi)一些研究結(jié)果相似[3-4]。這提示nm-23蛋白在肺癌的演進(jìn)過程中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平可作為判斷肺癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

VEGF通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血漿纖溶酶原激活劑(PA)及血漿纖溶酶原激活物的抑制劑(PAⅠ～Ⅱ)，促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)，從而利于血管形成。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要步驟，大量研究表明，若沒有血管供應(yīng)，腫瘤直徑不會(huì)超過2 cm。目前己知多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與了血管生成的調(diào)控，而VEGF可能是其中最關(guān)鍵的刺激因子[5]。在人體許多正常組織中VEGF呈低表達(dá)，但在大多數(shù)惡性腫瘤中卻高表達(dá)[6]，且表達(dá)程度與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)[7-8]，本研究得到相同的結(jié)論。此外，本研究結(jié)果顯示VEGF的基因表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、病理類型無關(guān)，但與其分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果相一致[9-13]；同時(shí)，研究結(jié)果還提示VEGF蛋白的表達(dá)與淋巴管生成數(shù)量呈正比，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，提示VEGF可能與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。目前，已有針對(duì)VEGF的藥物如重組人血管內(nèi)皮抑素(商品名：恩度)、抗VEGF單克隆抗體貝伐單抗(商品名：Avastin)等，其主要的藥理學(xué)機(jī)制就是通過減少VEGF與其相應(yīng)的受體結(jié)合，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成，達(dá)到抑制腫瘤的作用。

國(guó)內(nèi)眾多研究顯示，nm-23、VEGF基因在肺癌中無相關(guān)性，它們通過各自不同的途徑在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在NSCLC中nm-23、VEGF蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)性，提示這兩種蛋白在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中可能是相對(duì)獨(dú)立的事件。但我們的研究表明，nm-23、VEGF蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞分化、臨床分期等均有密切關(guān)系，提示我們可能可以通過檢測(cè)nm-23、VEGF蛋白的表達(dá)作為評(píng)價(jià)NSCLC生物學(xué)行為及預(yù)后的參考指標(biāo)之一。

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Expression and significance of nm-23 and VEGF protein in the patients with non-small cell lung cancer.YANG

Nuo1,MA Hui2,XIAN Lei1,CHEN Ming-wu1,GUO Jian-ji1,HU Song1.Department of Cardiothoracic Surgery1, Department of Enterohepatic Surgery2,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021, Guangxi,CHINA

ObjectiveTo study the expression and significance of nm-23 and vascular endothelial growth factor(VEGF)protein in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).MethodsThe expression of nm-23 and VEGF protein was detected in tumor tissues of 208 patients with NSCLC,adjacent tissues of 150 patients and lung tissues of 17 patients with benign lung disease by tissue microarray and immunohistochemistry.Results①The expression of nm-23 protein was significantly higher in NSCLC tumor tissues than that in adjacent tissues and benign lung tissues(P<0.01).The difference of nm-23 protein expression between different clinical stages and differentiations was significant(P<0.05).②The expression of VEGF protein was significantly higher in NSCLC tumor tissues than that in adjacent tissues and benign lung tissues(P<0.01).The difference of VEGF protein expression with different differentiations,clinical stages and lymph node metastasis was significant(P<0.05).Conclusion①nm-23 and VEGF protein is highly expressed in NSCLC and associated with the development of NSCLC,so they can be used for early diagnosis of NSCLC;②nm-23 protein is associated with the clinical stage and differentiation,and VEGF protein is associated with the differentiation,clinical stage and lymph node metastasis.

Tissue microarray;Immunohistochemistry;nm-23;Vascular endothelial growth factor(VEGF); Non-small cell lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2014）07—0941—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0366

2013-09-04)

廣西衛(wèi)生廳科研立項(xiàng)課題(編號(hào)：桂衛(wèi)Z2011329)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：桂科攻10124001A-44)；廣西留學(xué)回國(guó)人員科學(xué)基金(編號(hào)：桂科回0832011)

冼磊。E-mail：xianlei59@163.com