半夏厚樸湯抗抑郁作用
——改善腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平*

馬占強(qiáng)，李瑞鵬，李月碧，傅強(qiáng)，瞿融，馬世平**

1中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理教研室，南京 211198；2南京中醫(yī)藥大學(xué)方劑教研室，南京 210046

半夏厚樸湯抗抑郁作用
——改善腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平*

馬占強(qiáng)1，李瑞鵬1，李月碧1，傅強(qiáng)1，瞿融2，馬世平1**

1中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理教研室，南京 211198；2南京中醫(yī)藥大學(xué)方劑教研室，南京 210046

目的：通過觀察半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)和氧化應(yīng)激的影響，研究半夏厚樸湯抗抑郁的機(jī)制。方法：采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、開野實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)，研究半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用，并通過UPLC-T-QMS系統(tǒng)檢測(cè)其大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，部分動(dòng)物取其海馬制備海馬勻漿，Western blotting檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。結(jié)果：與空白組相比，模型組大鼠糖水消耗量顯著下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，交叉次數(shù)、直立次數(shù)顯著減少；海馬內(nèi)去甲腎上腺素、5-羥色胺含量顯著降低。與模型組相比，半夏厚樸湯組糖水消耗量顯著升高，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著縮短。半夏厚樸湯組顯著增加大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素和5-羥色胺含量。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，半夏厚樸湯組顯著升高SOD水平，顯著降低MDA水平。結(jié)論：半夏厚樸湯能明顯改善慢性應(yīng)激所致的大鼠抑郁行為，其機(jī)制可能與上調(diào)海馬內(nèi)去甲腎上腺素、5-羥色胺水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

半夏厚樸湯；抗抑郁；神經(jīng)遞質(zhì)；氧化應(yīng)激

抑郁癥（depression）是一種以心境障礙為主要特征的綜合征，呈慢性、反復(fù)性發(fā)作，通常表現(xiàn)為：情緒低落、思維遲緩、運(yùn)動(dòng)抑制、食欲和睡眠障礙、悲觀厭世以及言語動(dòng)作減少，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)自殺等極端自殘的念頭。其發(fā)病率正在快速攀升，預(yù)計(jì)到2020年時(shí)抑郁癥可能成為僅次于缺血性心臟病的第二大疾病，其對(duì)患者及其家屬造成的痛苦、對(duì)社會(huì)造成的損失是其他疾病所無法比擬的[1-2]。半夏厚樸湯出自《金匱要略》，其方藥組成為：半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉。該方為治療情志不暢、痰氣互結(jié)所致的梅核氣（慢性咽炎）之常用方。本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用多種動(dòng)物行為學(xué)模型證明半夏厚樸湯具有抗抑郁作用[3-4]。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激方法建立大鼠抑郁模型，觀察半夏厚樸湯對(duì)應(yīng)激大鼠行為學(xué)、氧化應(yīng)激的影響。

1 材料

1.1 儀器

電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，十萬分之一）；開野實(shí)驗(yàn)箱（直徑30 cm，高20 cm）；UPLC Acquity TM系統(tǒng)（Waters公司）；Synapt TM TQ質(zhì)譜儀（Waters公司），配有Lock-spray接口，電噴霧離子源（ESI）；Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件（Waters公司）；紫外凝膠成像系統(tǒng)、瓊脂糖水平電泳儀（BIO-RAD公司，美國(guó)）。

1.2 藥物與試劑

半夏厚樸湯方中藥材半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉等購自南京益豐大藥房，并經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源學(xué)教研室秦民堅(jiān)教授鑒定，藥材均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。將半夏厚樸湯各藥材按《金匱要略》原方比例配伍，裝入大圓底燒瓶中浸泡2 h，加8倍水加熱煮沸30 min，取出藥汁，再加入8倍水加熱煮沸30 min，過濾藥渣；取兩次藥汁合并蒸干后保存?zhèn)溆?，?jì)算浸膏得率為14.7%，使用時(shí)配制成所需濃度。鹽酸氟西?。ǔＶ菟乃幹扑幱邢薰?，規(guī)格：10 mg，批號(hào)：201107181）；抗體SOD（CST，2770S）；MDA（CST，5321S）；lumiGLO試劑（Cell Signaling，Beverly，MA）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重180～220 g，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033，飼養(yǎng)環(huán)境：中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持晝夜節(jié)律，室溫，自由飲水?dāng)z食。

2 方法

2.1 造模與給藥

參照文獻(xiàn)方法[5]。取雄性SD大鼠60只，按體重隨機(jī)分組為6組，分別為：空白組、模型組、氟西汀對(duì)照組、半夏厚樸湯低、中、高（濃度）6組。每組10只，置于單獨(dú)的鼠籠里，除常規(guī)空白組外其余5組給予連續(xù)3周的慢性不可預(yù)知性刺激：每天選取3～4個(gè)應(yīng)激因子，避免重復(fù)，持續(xù)21 d。選用的應(yīng)激因子包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、傾斜飼養(yǎng)（45°，12 h）、濕籠（灑100 mL水在墊料上）、持續(xù)光照（24 h）、噪音刺激（5 min）、搖晃鼠籠（5 min）、夾尾（距尾根1cm處夾閉1 min）。慢性刺激后，進(jìn)行給藥，每日給藥一次，連續(xù)給藥3周，各組均按1 mL/100 g的劑量灌胃，空白組和模型組給純凈水，氟西汀對(duì)照組給0.01 g·kg-1，半夏厚樸湯低、中、高組分別給3、6、12 g·kg-1，給藥期間繼續(xù)造模。

2.2 行為學(xué)觀察

2.2.1 糖水消耗實(shí)驗(yàn)給藥結(jié)束的第3天，分別測(cè)定各組大鼠的糖水消耗量（sucrose intake）。開始測(cè)量前禁水、禁食24 h，然后給予1%（w/v）的蔗糖水溶液，蔗糖水溶液分別置于2個(gè)相同的飲水瓶中，24 h后進(jìn)行糖水消耗量的測(cè)定。測(cè)量時(shí)大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，每籠1只，2個(gè)飲水瓶中分別裝有普通飲用水和1%蔗糖水溶液，24 h后稱量大鼠在普通飲用水、1%蔗糖水以及總液體的消耗量。比較正常大鼠、慢性應(yīng)激大鼠和給予半夏厚樸湯和鹽酸氟西汀的大鼠在糖水消耗及糖水偏愛方面的差異。糖水偏愛（sucrose preference，SP）以蔗糖水溶液的消耗量（g）/總液體的消耗量（g）×100%表示。

2.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)各組大鼠在給藥結(jié)束的第4天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。參照Porsolt等[6]方法，將大鼠置于水深30 cm、水溫25°C的玻璃圓筒中，觀察6 min，比較各組大鼠在后4 min內(nèi)的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間判定：大鼠漂浮在水面，不努力爬出圓筒，僅做一些必須保持其頭部在水面的動(dòng)作。

2.2.3 開野實(shí)驗(yàn)于給藥結(jié)束的第2天用開野實(shí)驗(yàn)裝置測(cè)定各組大鼠行為學(xué)的改變。參照Archer J等方法[7]，實(shí)驗(yàn)裝置為直徑150 cm、高50 cm的圓筒，在安靜的環(huán)境下進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)觀察，觀察指標(biāo)：以動(dòng)物穿越底面格子（行走路線與格子交叉點(diǎn)數(shù)）為水平活動(dòng)的次數(shù)，直立（兩前肢離地1 cm以上或攀附墻壁的次數(shù)）為垂直活動(dòng)次數(shù)，并測(cè)定洗臉次數(shù)。將大鼠置于中心格子內(nèi)適應(yīng)2 min后，記錄4 min內(nèi)大鼠自發(fā)活動(dòng)。

2.3 大腦海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定

測(cè)定樣本處理：大鼠直接斷頭，在冰臺(tái)上迅速取出腦組織，立即投入液氮中，精確稱重，每1 g腦組織加4 mL冰冷的甲醇液，于冰浴下快速玻璃棒攪拌勻漿。精密吸取1 mL勻漿液，4℃條件下14000 r·min-1離心20 min，取上清液真空冷凍干燥，殘留物用700 μL水溶解，渦漩振蕩10 s，加入氯仿-異丙醇（100∶30）混合液300 μL，渦漩振蕩2 min，離心（3000 r·min-1）5 min，取上層水相10 μL進(jìn)樣（LC）[8]。

2.4 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）

制備大鼠海馬蛋白樣品，用于SOD和MDA Western blot分析。采用Bradford法測(cè)定大鼠海馬樣品蛋白濃度（建成生物技術(shù)有限公司，中國(guó)南京），牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。蛋白（上樣量為75 μg）經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（孔徑為0.45 μm，Pall，USA），然后在5%脫脂奶粉中封閉2 h，在不同的一抗中4℃孵育過夜。PVDF膜經(jīng)0.5%TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。再與HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng)，再用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。最終膜用lumiGLO試劑孵育，然后用X光片顯出條帶，采用分析軟件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白與β-actin的灰度比值。所用一抗包括兔多克隆抗SOD（稀釋比例為1∶1000）、MDA（1∶1000）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1。與空白組相比，模型組大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加；與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量和氟西汀均能顯著縮短大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。

表1 半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠糖水偏好率、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間、開野實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響（±s，n=6）

表1 半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠糖水偏好率、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間、開野實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

開野實(shí)驗(yàn)組別劑量（g·kg-1）糖水偏好率（%）強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（s）穿格次數(shù)直立次數(shù)空白82.6±10.3132.9±27.481.5±27.111.5±2.8模型55.7±12.1##194.7±30.3##33.9±17.8##4.1±2.0##鹽酸氟西汀0.0175.8±11.9**140.0±32.7**67.4±22.3**8.8±2.6**366.3±13.6178.3±31.453.9±28.35.9±2.1半夏厚樸湯671.3±14.2*165.9±28.4*57.5±21.4*7.5±2.7*1274.3±15.3*147.6±26.9**61.5±27.2*7.9±1.9**

3.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1。與空白組大鼠比較，模型組大鼠糖水偏好率明顯降低；與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量與鹽酸氟西汀顯著升高大鼠糖水偏好率。

3.3 開野實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1。與空白組大鼠比較，模型組大鼠自發(fā)活動(dòng)能力明顯降低，表現(xiàn)為穿格次數(shù)、直立次數(shù)明顯減少；給予半夏厚樸湯后，與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量組大鼠的穿格次數(shù)、直立次數(shù)顯著增加。

3.4 大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

與空白組相比，模型組5-HT和NE含量均顯著減少。與模型組相比，鹽酸氟西汀組與半夏厚樸湯低、中、高劑量組5-HT、NE含量均顯著增加。見表2。

表2 半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（±s，n=10）

表2 半夏厚樸湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量（g·kg-1）5-HT（ng·mL-1）NE（ng·mL-1）空白-167.8±10.6196.3±9.2**模型-109.8±8.3##135.4±10.4##鹽酸氟西汀0.01157.4±11.9**177.4±8.2**3129.5±9.9*152.0±8.3**半夏厚樸湯6138.1±7.0**160.7±12.4**12149.2±7.2**170.5±8.8**

3.5 大鼠海馬內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量

與空白組相比，模型組SOD表達(dá)顯著減少，MDA表達(dá)顯著增加；與模型組相比，鹽酸氟西汀組SOD表達(dá)顯著增加，MDA表達(dá)顯著減少，半夏厚樸湯低、中、高劑量組SOD表達(dá)顯著增加，MDA表達(dá)顯著減少。見圖1。

4 討論

圖1 大鼠海馬內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的表達(dá)

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，慢性不可預(yù)見性應(yīng)激經(jīng)典模型常用于抑郁癥的病理生理機(jī)制和抗抑郁藥物作用機(jī)制的研究[9]。糖水偏好測(cè)定、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、開野實(shí)驗(yàn)均模擬了抑郁癥患者的快感缺乏、興趣缺失、精神運(yùn)動(dòng)遲滯等抑郁表現(xiàn)。而半夏厚樸湯在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中能明顯增加大鼠的糖水偏好率；在開野實(shí)驗(yàn)中能增加大鼠的自主活動(dòng)與探究能力；在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中能減少強(qiáng)迫游泳大鼠的不動(dòng)時(shí)間。諸此，證明了半夏厚樸湯的抗抑郁作用。

在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究中，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說占有重要地位，尤其與去甲腎上腺素、5-HT和多巴胺等這類大腦原有的，用來協(xié)助神經(jīng)元間信息傳導(dǎo)的物質(zhì)有關(guān)[10]。本研究通過UPLC-TQMS系統(tǒng)，對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的海馬區(qū)單胺類遞質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，半夏厚樸湯能提高大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素、5-HT遞質(zhì)含量。半夏厚樸湯的抗抑郁作用機(jī)制與提高大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量相關(guān)。

已有研究報(bào)道，抑郁癥的發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切[11-12]。抑郁癥是慢性的心理及生理應(yīng)激過程，可引起體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能變化，并伴有氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，重度抑郁癥患者體內(nèi)SOD的活性降低，而MDA的含量升高[13]，給予清除自由基的藥物，能改善大鼠的抑郁癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性抑郁模型大鼠大腦海馬MDA含量顯著升高，而SOD活性顯著降低，提示大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡，并出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化損傷；半夏厚樸湯低、中、高劑量組可顯著改善慢性抑郁模型大鼠抑郁癥狀，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半夏厚樸湯的抗抑郁作用機(jī)制除普遍認(rèn)為可調(diào)節(jié)抑郁動(dòng)物腦內(nèi)單胺類水平之外，還可能與清除腦部自由基、提高腦部抗氧化酶的活性有關(guān)。

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Antidepressant-like Effects of Banxia Houpu Decoction by Improving the State of Oxidative Stress in the Brain*

MA Zhan-qiang1,LI Rui-peng1,LI Yue-bi1,FU Qiang1,QU Rong2,MA Shi-ping1**
1Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica,School of Traditional Chinese Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2Discipline of Chinese and Western Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

Objective：To study the anti-depression mechanism of Banxia Houpu Decoction.Methods：Rat models were established by chronic unpredictable mild stress(CUMS),sucrose consumption,open-field and forced swimming tests were used to observe the behavior of the model rats.UPLC-T-QMS was used to analyze the levels of monoamine neurotransmitters.Western blotting detected the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in brain.Results：Compared with the normal group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the depressive disorder rats decreased significantly,the duration of immobility in forced swimming test increased significantly,the contents of 5-HT and NA reduced.Compared with the model group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the Banxia Houpu Decoction group rats increased significantly,the duration of immobility in forced swimming test decreased significantly.Western blotting analysis showed that, compared with the model group,Banxia Houpu Decoction could significantly elevate the levels of SOD,and significantly reduce the levels of MDA in hippocampus.Conclusion：Banxia Houpu Decoction improved the depression syndromes of rats induced by CUMS,of which the mechanism involved the upregulation of 5-HT and NE levels and enhancement of anti-oxidative stress ability.

Banxia Houpu Decoction;Anti-depression;Neurotransmitter;Oxidative stress

R965.1

A

1673-7806（2014）03-205-04

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助（BK2011630）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（JKQ2011036）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（CXZZ13_03）

馬占強(qiáng)，男，博士生 E-mail:mazhanqiang0427@163.com

**通訊作者 馬世平，男，教授，博士生導(dǎo)師 E-mail:spma@cpu.edu.cn

2014-03-20

2014-03-31