雙波長HPLC法同時測定婦科Ⅳ顆粒劑中芍藥苷和虎杖苷的含量

錢 俊，林 夏，王星星，劉莉莉，吳 云，蕭 偉

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，連云港 222001

婦科Ⅳ顆粒劑是根據(jù)江蘇省中醫(yī)院治療慢性盆腔炎的臨床經(jīng)驗方經(jīng)提取、精制而成。處方由蒲公英、黨參、大血藤、虎杖、赤芍、延胡索、皂角刺等中藥材組成，具有清熱除濕、化瘀止痛之功效。方藥以蒲公英等為君藥，具有益氣清熱的作用；以虎杖等為臣藥，具有清熱通絡的作用；以赤芍等為佐藥，具有清熱活血散瘀的作用?；⒄染哂欣麧裢它S、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效，其中活性成分虎杖苷具有抗菌、抗血栓形成、抗內(nèi)毒素、降低全血黏度等作用[1-2]。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，以芍藥苷為主的總苷為其主要活性成分，有非常明顯的抗凝血、抗血小板聚集及改善血液流變學異常，抗血栓形成的作用[3-4]。2010版《中國藥典》中虎杖及赤芍采用高效液相色譜法對虎杖苷和芍藥苷進行含量測定[5]，文獻報道的虎杖苷、芍藥苷含量測定方法多為單波長單項含量測定。為有效控制本制劑質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法同時檢測制劑中虎杖苷和芍藥苷含量，具有檢測靈敏度高，節(jié)省時間及成本低等優(yōu)點，提高了分析效率，所建立的含量測定方法可靠、準確、重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2487液相色譜儀。

芍藥苷對照品（批號：0736-200934）、虎杖苷對照品（批號：111575-200502）均購自中國食品藥品檢定研究院；婦科Ⅳ顆粒劑（批號：130901、130902、130903，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）；乙腈（色譜純，上海陸都化學試劑廠）；其余試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果[5-6]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液精密稱取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的芍藥苷、虎杖苷對照品適量，加甲醇制得每毫升含芍藥苷209.6 μg、虎杖苷137.5 μg的混合對照品溶液。搖勻，備用。

2.1.2 供試品溶液取本品適量，混勻研細（過60目），取細粉約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，精密稱定，超聲處理0.5 h，放置至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心取續(xù)濾液即得。

2.1.3 陰性供試品溶液分別取缺赤芍及缺虎杖的其他各味藥材，按“2.1.2”項的制備方法分別制備缺赤芍陰性供試品溶液及缺虎杖陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.10%磷酸（17∶83）；檢測波長：230 nm、306 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.3 系統(tǒng)適應性

在上述條件下，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算應不得低于6000，按虎杖苷峰計算應不得低于3000，分離度均大于1.5，已達到基線分離，拖尾因子在0.95～1.05之間。

2.4 專屬性實驗

分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在230 nm及306 nm波長下分別測定。結(jié)果表明：芍藥苷、虎杖苷與其他色譜峰達到基線分離，分離度均大于1.5，陰性對照液無干擾，說明在婦科Ⅳ顆粒劑中芍藥苷、虎杖苷的專屬性較強。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對照品溶液（A），婦科Ⅳ供試品溶液（B）和缺赤芍陰性供試品溶液（C）的230 nm處HPLC色譜圖

圖2 混合對照品溶液（A），婦科Ⅳ供試品溶液（B）和缺虎杖陰性供試品溶液（C）的306 nm處HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷和虎杖苷對照品適量，加甲醇分別制成每毫升含芍藥苷為1.048 mg、含虎杖苷為0.687 mg的溶液，作為儲備液。分別精密量取貯備液0.5、1、2、4、6、8 mL 至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得系列濃度混合對照品溶液，分別精密吸取各濃度混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，以進樣量為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標進行線性回歸。求得芍藥苷、虎杖苷回歸方程分別為 ：Y=10176X+415410 （r=0.9997）；Y=26787X+235762（r=0.9999）。 結(jié)果表明，芍藥苷在 0.524 μg～8.384 μg、虎杖苷在 0.344 μg～5.502 μg，與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取芍藥苷濃度為 209.6 μg·mL-1、虎杖苷濃度為 137.5 μg·mL-1的混合對照品溶液 10 μL，連續(xù)重復進樣6次，測定峰面積，計算得芍藥苷的峰面積值的RSD為0.10%，虎杖苷的峰面積值的RSD為0.13%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一供試品，共6份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件測定，測得樣品中指標成分芍藥苷的含量均值為9.20 mg·g-1，RSD=1.00%（n=6）；虎杖苷的含量均值為6.84 mg·g-1，RSD=1.00%（n=6）。結(jié)果表明此法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批號供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于 0、2、4、6、8、12 h 各進樣 1 次，測得芍藥苷和虎杖苷的峰面積積分值，計算，芍藥苷的峰面積的RSD為1.00%，虎杖苷的峰面積的RSD為1.30%，結(jié)果表明指標成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品 （芍藥苷含量9.20 mg·g-1，虎杖苷含量6.84 mg·g-1）適量，研細（過 60 目），平行取 6 份，0.25 g/份，精密稱定，分別精密加入濃度為1.145 mg·mL-1芍藥苷對照品溶液2 mL、濃度為1.710 mg·mL-1虎杖苷對照品溶液1 mL，揮干后，按“2.1.2”項下方法操作，精密吸取上述各供試品溶液10 μL，分別進樣分析。芍藥苷的平均回收率（n=6）為99.6%（RSD=0.92%）；虎杖苷的平均回收率 （n=6）為100.3%（RSD=1.32%）。

2.10 樣品含量測定

取 3批樣品，每批取 3份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件測定，分別吸取10 μL進樣，采用外標一點法定量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中芍藥苷、虎杖苷的含量測定結(jié)果（n=3）

3 討 論

3.1 波長的選擇。根據(jù)2010版《中國藥典》及芍藥苷和虎杖苷全波長掃描圖，選擇230 nm作為芍藥苷的檢測波長，306 nm作為虎杖苷的檢測波長。采用具有多波長檢測功能的紫外檢測器在各成分最佳檢測波長下同時進行檢測分析，提高了檢測的靈敏度及分析效率，節(jié)省了成本。

3.2 色譜條件優(yōu)選考察。比較了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.10%磷酸溶液3種流動相系統(tǒng)，兩種色譜柱 Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的分離效果，結(jié)果表明：選用乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)進行洗脫分離效果較好，兩種色譜柱均能使芍藥苷、虎杖苷色譜峰與相鄰色譜峰達到較好的分離（Rs>1.5）。

3.3 磷酸濃度選擇。流動相加入一定的磷酸是為了調(diào)節(jié)pH值，可減少拖尾，提高靈敏度[7]。比較了0.05%、0.10%、0.15%磷酸水溶液，0.05%濃度效果較后兩者為差，而0.10%與0.15%濃度效果無明顯差異?？紤]色譜柱的保護，最終流動相選擇乙腈-0.10%磷酸水溶液系統(tǒng)。

3.4 供試品溶液制備方法優(yōu)選考察?？疾炝颂崛》绞剑ǔ暋⒒亓鳎?、溶劑種類及濃度（甲醇、乙醇）、溶劑用量、提取時間，結(jié)果表明：以50 mL甲醇超聲0.5 h可以有效地提取芍藥苷和虎杖苷。

3.5 考察了不同柱溫、不同流速、不同進樣量對測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，本文所采用的色譜條件耐用性良好。

3.6 本實驗用HPLC法同時測定婦科Ⅳ顆粒中2種主要有效成分含量，結(jié)果顯示，該法方便、準確、靈敏度高、重復性好，可用于婦科Ⅳ顆粒劑的質(zhì)量控制。

[1] 伍曉春，陸 豫.虎杖的藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 中醫(yī)藥信息，2005，22（2）：22-5.

[2] 張海防，竇昌貴，顧菲菲.虎杖清熱解毒藥理作用的研究進展[J]. 中藥材，2003，26（8）：606-10.

[3] 王琳琳，丁安偉.赤芍總苷對大鼠血瘀證模型的影響[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2011，27（6）：552-4.

[4] 馬雙成，鄧少偉.赤芍總苷的生產(chǎn)工藝條件研究[J].中草藥，1998，29（10）：664-7.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：147，194.

[6] 程東方，謝紀珍，賈元印.HPLC法測定血康顆粒中芍藥苷的含量[J]. 藥學研究，2013，32（3）：150-2.

[7] 谷滿倉，錢亞芳，呂圭源.白芍的化學成分及質(zhì)量控制方法研究進展[J]. 科技通報，2006，22（3）：337-44.