梔子大黃湯有效成分在體腸吸收研究*

李允，郎巧玲，馮芳，2**，史清水

中國藥科大學 1藥物分析教研室；2藥物質(zhì)量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；3江蘇省食品藥品檢驗所,南京 210008

梔子大黃湯有效成分在體腸吸收研究*

李允1，郎巧玲1，馮芳1，2**，史清水3

中國藥科大學1藥物分析教研室；2藥物質(zhì)量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；3江蘇省食品藥品檢驗所,南京 210008

目的：研究梔子大黃湯中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷4種有效成分的大鼠在體腸吸收動力學。方法：運用大鼠在體單向灌流重量法進行腸吸收實驗，考察不同吸收部位和藥物濃度下的腸吸收動力學，采用HPLC法測定有效成分的濃度。結(jié)果：梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷在小腸的吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff）顯著大于結(jié)腸（P＜0.05）；橙皮苷在十二指腸和空腸吸收參數(shù)顯著大于回腸和結(jié)腸（P＜0.05）；藥物濃度在一定范圍內(nèi)對梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷的Ka和Peff無顯著影響（P＞0.05），橙皮苷的Ka和Peff隨濃度的升高先增加后降低。結(jié)論：梔子大黃湯中4種有效成分在全腸道均有吸收；梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷的吸收機制為被動擴散，橙皮苷在吸收過程中存在高濃度飽和現(xiàn)象，推測吸收機制為主動轉(zhuǎn)運或易化擴散。

梔子大黃湯；活性成分；在體單向灌流；HPLC法

梔子大黃湯來源于《金匱要略》，由梔子、大黃、枳實、淡豆豉組成。臨床主要用于治療酒精性肝病、急性肝炎、病毒性肝炎。本實驗室前期研究已經(jīng)證實，該方的主要有效成分為梔子苷、橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷[1]。中藥多以水煎液口服給藥，胃腸道吸收對藥效具有重要的影響。當前關于腸吸收的實驗多以單體有效成分進行研究，本文直接使用梔子大黃湯水煎液進行大鼠在體單向灌流，以方中主要藥效成分為研究對象，探討其在不同吸收部位、不同濃度下的腸吸收動力學，以期為梔子大黃湯的臨床藥動學和藥效學的深入研究提供理論依據(jù)，為中藥新劑型的研究提供必要的生物藥劑學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C高效液相色譜儀、LC-solution工作站（日本島津公司）；Anke TGL-16B高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥材與試劑

生梔子（產(chǎn)地：江西，批號：070418）、生大黃（產(chǎn)地：甘肅，批號：070618）、炒枳實（產(chǎn)地：江西，批號：071019）、淡豆豉（產(chǎn)地：江蘇，批號：090523），均購自南京先聲藥店。經(jīng)中國藥科大學中藥學院秦民堅教授鑒定：梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis.的干燥成熟果實；大黃為蓼科植物藥用大黃Rheum officinaleBaill.的根和根莖；枳實為蕓香科植物甜橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果；淡豆豉為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品；以上4味藥材粉碎，過60目篩，待用。

梔子苷對照品（批號：12041808）、柚皮苷對照品（批號：12030612）、橙皮苷對照品（批號：12020304）、新橙皮苷對照品（批號：12030701），均購自成都曼思特公司。Krebs-Ringer試劑（K-R營養(yǎng)液，自制）；其余試劑為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，（200±20）g，購自南京青龍山動物養(yǎng)殖中心，合格證號：SCXK（蘇）2013-0001。

2 方法

2.1 梔子大黃湯的制備

取梔子9 g、大黃3 g、枳實12 g、淡豆豉24 g，粉碎，10倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，過濾，濾渣繼續(xù)提取2次，合并濾液；濃縮至60 mL，即得。湯劑中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量分別約為3.22%、9.86%、0.67%、5.96%。

2.2 灌流液中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC法測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：LiChrospher-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%乙酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫，洗脫程序如下：0 min 5%B，12.5 min 30%B，26.8 min 36%B，50 min 45%B，55～60 min 95%B，61～70 min 5%B；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：258 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25℃。

2.2.2 腸灌流液樣品的配制按照“2.1”項下方法制備梔子大黃湯水煎液，精密吸取約5.70 mL，置于100 mL量瓶中，加K-R液稀釋至刻度，即得。

2.2.3 樣品處理精密移取1 mL腸灌流液樣品，加入95%乙醇2.8 mL，振搖、密閉，取適量，16000 r· min-1離心10 min，取上清液進樣分析。

2.3 大鼠在體腸吸收實驗

2.3.1 大鼠在體腸單向灌流方法試驗前用供試液將管道沖洗至出液口藥物濃度與供試液濃度相同。取大鼠，腹腔注射20%的烏拉坦（5 mL·kg-1）麻醉，分離出待考察的腸段（十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），各取約10 cm，小心插入硅膠管（2 mm i.d.；4 mm o.d.）并結(jié)扎。用預熱至37℃的生理鹽水沖洗腸道，穩(wěn)定10 min后通入空氣，將腸道內(nèi)剩余液體排盡，然后用預熱至37℃的腸灌流液進行在體單向灌流。實驗開始前先以實驗灌流液（37℃）灌充腸段，以0.20 mL·min-1的灌流速度[2-3]平衡30 min[4-5]，吸收達到穩(wěn)定狀態(tài)后，收集30～45、45～60、60～75、75～90、90～105 min時間段內(nèi)的灌流液樣品。收集到的樣品存儲于-20℃冰箱中，以待后續(xù)分析。

2.3.2 大鼠腸吸收動力學參數(shù)的計算與統(tǒng)計分析將灌流后收集到的腸灌流液樣品按照“2.2.3”項下進行處理，按照“2.2.1”色譜條件進行HPLC法分析，以重量法計算各組的吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff），并采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對各組吸收參數(shù)進行單因素方差分析。公式為：

式中：Cin和Cout分別為腸道進口和出口灌流液的濃度（μg·mL-1）；Q為灌流速度（0.2 mL·min-1）；Vin和Vout分別為灌入和收集的供試液的體積（mL，假定供試液的密度為1.0 g·mL-1，根據(jù)測得的質(zhì)量計算體積）；L為灌流腸段的長度（cm）；R為灌流腸段的橫截面半徑（0.18 cm[6]）；A為灌流腸段的表面積（cm2），V為灌流腸段的體積（cm3）。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察

以空白K-R液作為腸灌流液進行大鼠在體單向灌流，即得空白腸灌流液。分別制備空白腸灌流液、空白腸灌流液加混合對照品溶液、含藥腸灌流液樣本，按照“2.2.3”項下進行處理，進樣。結(jié)果表明，空白腸灌流液及湯劑中的其他成分不干擾測定。結(jié)果見圖1。

圖1 梔子大黃湯腸灌流液色譜圖

3.2 線性關系考察

分別取各對照品適量，置20 mL量瓶中，加入空白腸灌流液定容，得對照品儲備液。分別精密吸取儲備液10、5、2.5、1、0.4 mL于20 mL量瓶中，加入空白腸灌流液配制成系列混合對照品溶液，按照“2.2.3”項處理后進樣、測定，結(jié)果見表1。

表1 4種物質(zhì)的標準曲線及線性范圍

3.3 精密度測定

分別配制低、中、高3種濃度的模擬腸灌流液樣品，重復測定5次，連續(xù)測定5天，計算日內(nèi)、日間精密度。各物質(zhì)日內(nèi)、日間精密度均在0.11%～1.35%，符合方法學要求。

3.4 提取回收率

配制低、中、高3種濃度的模擬腸灌流液樣品，依法處理、分析，結(jié)果表明，各測定成分的提取回收率均在96.7%～104.8%（n=5）。

3.5 穩(wěn)定性考察

配制低、中、高3種濃度的供試品溶液，置于37℃水浴中，分別于0、30、60、90、120 min取樣，測定結(jié)果顯示4種物質(zhì)在灌流液中2 h穩(wěn)定。

分別考察上述供試品室溫放置8 h，3次反復凍融，-20℃冰柜中放置10 d的穩(wěn)定性，以及處理后樣本4℃進樣器放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，樣本上述條件下均無明顯變化。

3.6 藥物腸吸收影響因素考察

3.6.1 藥物在不同腸段的吸收情況取4只大鼠，分別取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸段，分別對其進行單向灌流。結(jié)果見表2。

表2 梔子大黃湯中4種特征成分在不同腸段的吸收參數(shù)（±s，n=4）

表2 梔子大黃湯中4種特征成分在不同腸段的吸收參數(shù)（±s，n=4）

注：與空腸段相比，*P＜0.05，**P＜0.01

梔子苷新橙皮苷柚皮苷橙皮苷腸段KaKa Ka（×10-2min-1）（×10-2min-1）Peff（×10-3cm·min-1）（×10-2min-1）Peff（×10-3cm·min-1）（×10-2min-1）Peff（×10-3cm·min-1）KaPeff（×10-3cm·min-1）十二指腸1.53±0.051.41±0.052.49±0.272.34±0.2710.08±1.4611.10±1.992.55±0.092.40±0.09空腸1.93±0.331.79±0.322.74±0.472.57±0.4510.69±1.0811.75±1.492.65±0.312.49±0.30回腸1.30±0.171.21±0.162.21±0.192.11±0.196.75±1.55**7.54±2.06**2.20±0.212.10±0.21結(jié)腸0.77±0.25*0.71±0.24*1.46±0.31*1.37±0.31*5.48±1.60**5.89±1.98**1.55±0.57*1.31±0.33*

結(jié)果顯示，梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷的主要吸收部位均為空腸、十二指腸和回腸，且三個腸段間的吸收均無顯著差異（P＞0.05），但顯著大于結(jié)腸（P＜0.05）；橙皮苷的主要吸收部位為空腸和十二指腸，與回腸和結(jié)腸的Ka和Peff有極顯著差異（P＜0.01）。由此可知，梔子大黃湯中的4種有效成分主要在小腸吸收，結(jié)腸吸收較少。

3.6.2 藥物不同濃度對腸吸收的影響分別量取2.85、5.70、11.40mL的梔子大黃湯溶液于3個100mL量瓶中，用K-R液配制成低、中、高3種濃度（分別相當于人用劑量的0.5倍、1倍和2倍）的腸灌流液樣品，對大鼠空腸段進行單向灌流實驗，結(jié)果見表3。

表3 梔子大黃湯中4種物質(zhì)在不同濃度下的吸收參數(shù)（±s，n=4）

表3 梔子大黃湯中4種物質(zhì)在不同濃度下的吸收參數(shù)（±s，n=4）

注：與低濃度組相比，*P＜0.05

梔子苷柚皮苷橙皮苷新橙皮苷KaPeff（×10-3cm·min-1）濃度KaPeff（×10-3cm·min-1）Peff（×10-3cm·min-1）Ka Ka （×10-2min-1）（×10-2min-1）（×10-2min-1）（×10-2min-1）Peff（×10-3cm·min-1）低2.13±0.101.99±0.102.82±0.372.67±0.368.06±0.238.49±0.362.63±0.252.49±0.23中2.18±0.292.05±0.302.83±0.392.68±0.3710.31±0.65*12.00±1.78*2.69±0.282.56±0.29高2.19±0.512.10±0.512.81±0.302.74±0.319.55±0.87*11.91±1.43*2.68±0.312.60±0.32

結(jié)果顯示，梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷在不同濃度下的吸收參數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；隨濃度的升高，橙皮苷的吸收先增加后降低，低濃度與中、高濃度的吸收參數(shù)有顯著差異（P＜0.05），說明梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷在空腸的吸收均以被動擴散為主，橙皮苷的吸收機制可能為主動轉(zhuǎn)運或易化擴散。

4 討論

在體灌流方法主要包括在體單向腸灌流和在體循環(huán)腸灌流，在體循環(huán)腸灌流因灌流時間長和灌流速度較大，對腸黏膜的損傷較大；單向灌流的灌流速度接近體內(nèi)腸道的環(huán)境，吸收速率穩(wěn)定，與人體有良好的相關性。Parvin等[7]給出了大鼠與人體的Peff相關性計算公式：Peff，human=11.04Peff，rat-0.0003（cm·s-1），根據(jù)該計算公式，梔子大黃湯中的梔子苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在人體空腸的Peff分別約為2.94×10-5cm·s-1、2.52×10-4cm·s-1、1.60× 10-3cm·s-1、1.82×10-4cm·s-1。

單向灌流實驗表明，4種特征成分的主要吸收部位為小腸上段，推測可能是因為4種物質(zhì)均含有多個羥基和/或酚羥基，具有弱酸性，小腸上段的pH相對較低，藥物多以非解離型存在，較易透過小腸黏膜從而使其吸收較大。腸上皮細胞腔側(cè)面膜中含有P-糖蛋白（P-gp），可以將已經(jīng)吸收入腸上皮細胞的藥物轉(zhuǎn)運回腸腔，從而降低口服藥物的生物利用度。橙皮苷在不同濃度下的Ka有顯著差異，可能是由于P-gp參與其腸道吸收的原因。研究表明，P-gp在腸道的吸收具有明顯的劑量依賴性[8]，低劑量給藥時，P-gp對藥物的外排作用很大；高劑量下，P-gp介導的分泌轉(zhuǎn)運達到飽和，導致藥物吸收增加。本研究中提示，橙皮苷可能是受到P-gp外排作用的影響。此外，Valenzuela[9]、Takara[10]等均指出大鼠腸道內(nèi)P-gp的水平自近端（近幽門）至遠端（回盲管）逐漸升高，且在結(jié)腸也有明顯的表達，因此推測橙皮苷在十二指腸段和空腸段的吸收顯著大于回腸段和結(jié)腸段，可能與P-gp在不同腸段的表達水平有關，但要確定橙皮苷是否為P-gp底物，還有待進一步研究。

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Intestinal Absorption Studies of the Active Components in Zhi-Zi-Da-Huang Decoction*

LI Yun1,LANG Qiao-ling1,FENG Fang1,2**,SHI Qing-shui3
1Department of Pharmaceutical Analysis;2Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance, China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;3Jiangsu Institute of Food and Drug Control,Nanjing 210008,China

Objective：To study thein vivointestinal absorption kinetics of geniposide(GE),naringin (NA),hesperidin(HE)and neohesperdin(NE)in Zhi-Zi-Da-Huang Decoction(ZZDHD).Methods：The in situ single-pass perfusion gravimetric method was adopted to investigate the influence of absorption site and drug concentration on the rat intestinal absorption.The HPLC was used to measure the contents of GE, NA,HE and NE.Results：For GE,NA and NE,their absorption parameters,theKaandPeff,in the small intestines were significantly different from those in the colon(P＜0.05);the absorption of HE decreased significantly in ileum and colon than in duodenum and jejunum(P＜0.05).Within a certain range of concentration,GE,NA and NE had no significant variation ofKaandPeff(P＞0.05),while the absorption of HE first increased and then decreased with the increase of drug concentration(P＜0.05).Conclusion：The four active components in ZZDHD could be absorbed in the whole intestinal canal of rats.The absorption of GE,NA and NE in rat intestine appeared to be by the passive diffusion mechanism while that of the HE was prelimnarily determined to be by an active transport or facilitated diffusion mechanism.

Zhi-Zi-Da-Huang Decoction;Active components;In situ single-pass perfusion;HPLC

R965

A

1673-7806（2014）03-197-04

國家自然科學基金項目（No.81274063）

李允，女，碩士生 E-mail:liyun9002@163.com

**通訊作者 馮芳，女，教授 E-mail:fengfangl@163.com

2014-02-19

2014-03-05