RT—PCR在我院手足口病檢測中的應(yīng)用

摘要：目的 探究RT-PCR技術(shù)檢測手足口病的準(zhǔn)確性，為后期臨床監(jiān)測提供參考。方法 選取我院門診收入的200例手足口病患兒作為研究對(duì)象，隨機(jī)選取其腸道、肛門、咽拭子樣本共320例。使用RT-PCR技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行定性檢測，觀察檢測結(jié)果并進(jìn)行分析。結(jié)果 本研究中檢出EV71陽性病毒105例，CoxA16陽性病毒51例，EV陽性病毒11例。兩種熒光RT-PCR檢測技術(shù)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測手足口病具有重要作用，值得在后期臨床中推廣及使用。

關(guān)鍵詞：RT-PCR技術(shù)；手足口?。粰z測；臨床應(yīng)用

手足口病（HFMD）是兒童中常見的一種傳染性疾病，屬于我國法定的報(bào)告管理型丙類傳染病。該癥的患者常于口、足、手等部位出現(xiàn)皰疹或皮疹，同時(shí)伴有不同程度的發(fā)熱癥狀，病情嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致腦炎、神經(jīng)源肺水腫、無菌性腦膜炎、心肌炎和急性遲緩麻痹等。手足口病的主要致病病毒是腸道71型病毒（EV71）和柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）。部分患者在感染手足口病病毒后，病情進(jìn)展迅速，患者的死亡速度快。手足口病標(biāo)本采集應(yīng)盡量在發(fā)病3d內(nèi)完成，咽拭子標(biāo)本的檢出率高于血清標(biāo)本，為提高標(biāo)本的檢出率，應(yīng)注意采集技術(shù)，提高標(biāo)本質(zhì)量[1]。筆者特于2013年1月～2014年1月選取我院收集的320例腸道、肛門、咽拭子樣本，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行研究，取得較好的成效，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我院2013年1月～2014年1月由門診收入的200例疑似手足口病患兒作為研究對(duì)象，隨機(jī)選取其腸道、肛門、咽拭子樣本共320例。手足口病的診斷參照我國衛(wèi)生部2011年修訂的手足口病的預(yù)防控制指南[2]。其中，重癥者112例，非重癥者88例；肛拭樣本86例，大便116例，咽拭子118例。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑 選擇SLAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀器、離心機(jī)、金屬浴等。使用由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2.2操作方法 提取RNA：由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書對(duì)本組320例樣本中的RNA進(jìn)行提取，得到的60 μL經(jīng)處理后的RNA提取物于零下20℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增技術(shù)：使用核酸熒光PCR的檢測混合液15 μL，及酶混合液5 μL，待確認(rèn)好各種試劑的使用總量后，混勻試劑并分裝至20 μL的單支反應(yīng)管中。分別將5 μL處理完畢的待測RNA樣本、陽性及陰性參考品加入20 μL的單支反應(yīng)管中，每管的最終體積為25 μL。具體反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30 min 50℃，預(yù)變性5 min 95℃，后經(jīng)10 s 95℃和40 s 55℃各45個(gè)循環(huán)，55℃時(shí)使用熒光檢測，檢測時(shí)通道為VIC，ROX，F(xiàn)AM。

1.3觀察指標(biāo) 使用VIC通道檢測腸道病毒71型，ROX通道檢測腸道通用型病毒，F(xiàn)AM通道檢測柯薩奇病毒中A組16型病毒。三者判定條件相同：檢測樣品的Ct值≥35，呈S型擴(kuò)增曲線或有顯著的指數(shù)增長期，則判定為樣品中CoxA16/EV 71/EV為陽性；若檢測Ct值在35～38，需對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，若結(jié)果相同且呈S型擴(kuò)增曲線或有顯著的指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則判定陰性；若檢測Ct值>38或無數(shù)值，則判定為陰性[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)的收集與處理均由我院數(shù)據(jù)處理中心專門人員進(jìn)行，保證數(shù)據(jù)真實(shí)性與科學(xué)性。初步數(shù)據(jù)錄入EXCEL（2003版）進(jìn)行邏輯校對(duì)與分析，得出清潔數(shù)據(jù)采用四方表格法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析結(jié)果以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩種方法的核算檢測結(jié)果分析 多重?zé)晒饧夹g(shù)檢測肛拭陽性數(shù)70例，單重?zé)晒?7例；多重?zé)晒鈾z測大便陽性數(shù)103例，單重?zé)晒?07例；多重?zé)晒鈾z測咽拭陽性數(shù)64例，單重74例，見表1。

2.2癥狀不同患者的核酸檢測結(jié)果分析 本研究中檢出EV71陽性病毒105例，CoxA16陽性病毒51例，EV陽性病毒11例，見表2。

3結(jié)論

手足口病是常見的一種腸道疾病，容易在兒童中感染發(fā)展為重癥，引起患兒死亡，因此，受到了社會(huì)各界及患者家屬的高度關(guān)注和重視，快速檢測對(duì)于疾病的治療和挽救患者生命均具有重要意義。傳統(tǒng)檢測手足口病病毒的方法是組織培養(yǎng)分離，但該方式具有一定程度的局限性，不適用于臨床的常規(guī)檢測。隨著該癥的發(fā)展，需要一種特異性高，且可快速檢測病原的檢測方式。

PCR技術(shù)是一種快速的檢測方式，其被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代的日常檢測工作。近年來，具有特異性的熒光探針的PCR熒光技術(shù)，不僅可降低擴(kuò)增產(chǎn)物的污染風(fēng)險(xiǎn)，而且其特異性、靈敏度與檢測時(shí)間均具有顯著的優(yōu)勢(shì)。尤其是在檢測病毒學(xué)病源時(shí)，由于培養(yǎng)病毒的條件較難滿足，導(dǎo)致其時(shí)效性和敏感性較差，而熒光RT-PCR技術(shù)則可以較好的解決這個(gè)問題。在手足口病的檢測中，使用RT-PCR技術(shù)通過應(yīng)用多通道的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增儀，實(shí)現(xiàn)了單支管內(nèi)同時(shí)檢測CoxA16、EV71及EV這三種手足口病病毒。本次手足口病的核酸檢測結(jié)果顯示，200例研究對(duì)象中EV71陽性率為52.5%（105/200），CoxA16陽性率為25.5%（51/200），EV陽性率為5.5%（11/200），表明EV71病毒是手足口病流行的主要病原；其中重癥者112例，85例（75.9%）顯示為陽性，其病原分布的特征與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道大致相同。RT-PCR技術(shù)的應(yīng)用，可顯著縮短操作時(shí)間，縮短了檢測周期，提升了工作效率，節(jié)約了成本。

本次研究結(jié)果顯示，多重?zé)晒鈾z測肛拭陽性數(shù)70例，單重77例；多重大便陽性數(shù)103例，單重107例；多重咽拭陽性數(shù)64例，單重74例，多重及單重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)在檢測大便、肛拭、咽拭子樣本的結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。更好地證明RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測手足口病的重要作用。同時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用顯著縮短了操作時(shí)間，減少了工作量，節(jié)約了成本，尤其對(duì)疾病的控制和治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]顏玉炳，蘇成豪，劉紅蓮，等.手足口病EV71和CoxA16檢出率的影響因素分析[J].廈門市疾病預(yù)防控制中心，福建36102，海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（3）.

[2]唐彥，侯俊，徐軍，等.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測手足口病病原體方法的建立及初步應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25（2）：152-154.

[3]葉榮夏，張永樂，潘克女，等.腸道病毒71型與柯薩奇病毒16型病原體檢測在手足口病流行中的意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（7）：1295-1296.編輯/肖慧