腸道病毒71型感染宿主固有免疫應(yīng)答研究進(jìn)展

摘要：腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）感染嚴(yán)重危害兒童生命安全。其致病機(jī)理尚未完全明確。EV71感染既可以激活模式識別受體誘導(dǎo)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，病毒自身也進(jìn)化出獨特的機(jī)制逃避固有免疫的殺傷。此外，固有免疫應(yīng)答也與EV71致病機(jī)理、臨床特點密切相關(guān)。本文就以上方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述及討論。

關(guān)鍵詞：腸道病毒71；固有免疫；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；Ⅰ型干擾素；細(xì)胞因子

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是除脊髓灰質(zhì)炎病毒外最重要的嗜神經(jīng)型病毒之一。主要感染學(xué)齡前兒童，臨床表現(xiàn)輕重不一，從輕微的手足口病或皰疹性咽峽炎，到無菌性腦膜炎、腦炎、肺水腫和死亡[1]，目前尚無有效的藥物和預(yù)防手段。EV71引起疾病不同臨床表現(xiàn)的機(jī)制至今尚不清楚，推測與EV71感染導(dǎo)致異常的免疫反應(yīng)有關(guān)。動物機(jī)體對病毒感染的免疫應(yīng)答分為固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩個層次。其中，固有免疫應(yīng)答不但是機(jī)體抵抗病毒侵染的第一道防線，而且負(fù)責(zé)啟動和調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)性免疫，在整個抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的作用[2]?，F(xiàn)就EV71感染宿主固有免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展綜述如下。

1 固有免疫與病毒感染

固有免疫也稱天然免疫，是宿主防御病原體入侵的首道屏障。主要通過胚系編碼的模式識別受體（PRRs）識別病原微生物保守的相關(guān)分子模式（PAMPs），實現(xiàn)對外來病原體的早期識別，進(jìn)而啟動固有免疫的效應(yīng)機(jī)制。病原體入侵宿主，PRRs迅速激活，通過特異的信號級聯(lián)反應(yīng)活化轉(zhuǎn)錄蛋白，從而誘導(dǎo)靶基因、促炎細(xì)胞因子、Ⅰ型干擾素（Ⅰ型IFN，INF-α/β）等的表達(dá)，誘導(dǎo)感染部位產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，吸引并激活巨噬細(xì)胞（MC）和樹狀突細(xì)胞（dDCs）等免疫細(xì)胞，從而清除病原微生物；同時上調(diào)抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面共刺激分子的表達(dá)，誘導(dǎo)T或B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化為效應(yīng)T或B細(xì)胞，產(chǎn)生病原特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。固有免疫和適應(yīng)性免疫在感染的各個階段協(xié)同作用，最終清除入侵的病原微生物。

病毒釋放的PAMPs主要是核酸類物質(zhì)，包括病毒基因組DNA、單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、5'三磷酸RNA和表面糖蛋白等[3]。宿主PRRs主要有四類[4]：Toll樣受體家族（TLRs）、RIG-Ⅰ樣解旋酶受體家族（RLRs）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLRs）的一些成員，以及ERIS（STING/MITA）等蛋白質(zhì)。PRRs分布在不同類型的細(xì)胞，不同的PRRs識別不同的PAMPs，并具有細(xì)胞特異性，激活不同的信號通路[5]。

已知哺乳動物有13種TLRs，表達(dá)在DCs、MC、淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要識別病毒DNA及RNA成分，TLR2、TLR4識別病毒糖蛋白[3]。RLRs有三個成員：視磺酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ，DDX58，DEAD）、黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5、IFIH1）和遺傳學(xué)和生理實驗室蛋白2（LGP2），RLRs在包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞表達(dá)，可以識別細(xì)胞內(nèi)RNA病毒成分[3]。另外兩類PRRs主要識別細(xì)胞內(nèi)DNA[4]。

2 EV71感染的固有免疫識別

體外和動物研究的結(jié)果表明，小RNA病毒EV71與其他家族成員一樣，通常由TLRs與RLRs識別其核酸[3]。Gong X等[6]經(jīng)RT-PCR證實，感染EV71的人單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞（MDMs），TLR2、TLR7和TLR8的表達(dá)顯著增強(qiáng)，增強(qiáng)的IL-8和TLR2基因表達(dá)也在紫外線失活EV71感染的MDMs發(fā)現(xiàn)，分析很可能是細(xì)胞表面上的TLR2和病毒蛋白相互作用的結(jié)果，認(rèn)為TLR2，TLR7和（或）TLR8參與了EV71相關(guān)分子模式的識別。雖未直接檢測到TLR3表達(dá)增加，但另一研究觀察到感染細(xì)胞中TLR3信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）下調(diào)和干擾素刺激基因（ISG）磷酸化抑制，表明EV71和TLR3之間有關(guān)聯(lián)[7]。另外，EV71 3C蛋白酶（3Cpro）與RIG-Ⅰ相互作用，隨后破壞RIG-Ⅰ依賴的Ⅰ型IFN反應(yīng)所需的RIG-Ⅰ-IPS-1復(fù)合體[8]，提示RIG-Ⅰ途徑可能參與識別EV71。最近，Kuo RL等[9]使用EV71 RNA作為激動劑，在基因敲除實驗中顯示MAD5表達(dá)減少，IRF3的活化與IFN-βmRNA表達(dá)相應(yīng)降低，表明MDA5參與了EV71的PAMP識別。

PRRs基因的多態(tài)性也可能是EV71感染的危險因素。有國內(nèi)的學(xué)者[10]檢測了87例有癥狀的EV71患者與57例無癥狀EV71感染對照組TLR3、RIG-Ⅰ以及MDA5的基因多態(tài)性，有序Logistic回歸分析顯示MDA5（rs1990760）的多態(tài)性與EV71感染的嚴(yán)重程度相關(guān)。提示通過調(diào)查EV71感染固有免疫機(jī)制，有可能識別高危嬰幼兒。

3 EV71感染宿主固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)答

EV71與其他小核糖核酸病毒的RAN被免疫細(xì)胞識別后，通過招募特異接頭蛋白激活一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[3]。目前公認(rèn)的大部分TLRs通過髓樣分化因子88（MyD88）途徑傳導(dǎo)信號，進(jìn)而活化白介素1受體相關(guān)因子激酶（IRAKs）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），最終激活I(lǐng)RF7和核因子-κB（NF-κB），誘導(dǎo)IFN-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。而TLR3則通過干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）途徑（即MyD88 非依賴途徑），一方面通過激活TBK1（TANK-binding kinase1）或IKK（IκB kinase）激酶復(fù)合體，活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3或IRF7，最終誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)；另一方面，通過激活I(lǐng)KKs活化NF-κB，最終誘導(dǎo)一系列炎癥因子的表達(dá)[4]。RIG-Ⅰ和MDA5識別雙鏈RNA后，激活下游的接頭蛋白IFN-β啟動刺激因子（MAVS，IPS-1、VISA或Cardif），MAVS招募TRAF3或TRAF6形成功能復(fù)合體，從而進(jìn)一步激活激酶TBK1/IKK-i或IKKs。TBK1/IKK-i使得IRF3或IRF7發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)；而IKKs通過激活NF-κB，誘導(dǎo)一系列炎癥因子的表達(dá)[4]。

Ⅰ型IFN的早期感應(yīng)及活動，使細(xì)胞迅速建立抗御病毒感染狀態(tài)，抑制病毒復(fù)制及傳播。然而，EV71誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生的研究結(jié)果并不一致。起初在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，早期使用重組IFN-αA，保護(hù)小鼠對抗EV71感染，而用抗IFN-α/β中和抗體預(yù)處理，則極大地提高了小鼠對EV71的易感性，死亡率及組織病毒載荷增加；雖然證實Ⅰ型IFNs對EV71感染的保護(hù)作用，但EV71接種沒有引起小鼠血清Ⅰ型IFNs增加[11]，也不能誘導(dǎo)人類MDMs釋放IFN-α[6]。臨床上，傳統(tǒng)的干擾素治療對EV71感染患者療效輕微。不過，最近一項研究證明EV71感染過程中可適度刺激INF的生產(chǎn)，但EV71誘導(dǎo)的INF或外源性INF治療不能有效觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)以抑制病毒的復(fù)制[12]。對于這些矛盾的結(jié)果，目前學(xué)者們公認(rèn)與EV71進(jìn)化了機(jī)制以逃避宿主免疫殺傷有關(guān)。

細(xì)胞炎癥因子的分泌是構(gòu)成防御病毒的第一道防線的重要部分，然而，也與EV71感染的發(fā)病機(jī)理密切關(guān)聯(lián)。臨床研究顯示，EV71感染伴自主神經(jīng)功能失調(diào)患者IL-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的血漿水平升高[13]，并發(fā)腦炎與肺水腫患者IL-1β、IL-6水平顯著高于無并發(fā)癥的患者[14-16]。因此，升高的IL-6可能代表了IL-1β和TNF-α生物學(xué)作用的\"網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)\"。近年陸續(xù)報告EV71感染患者血液和腦脊液IL-10、IL-13、IFN-γ、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、MIG（IFN-γ誘導(dǎo)單核因子）、IL-1受體拮抗劑和粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）等增高，并與與EV71疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[15-17]，說明由IL-6、IL-1β和TNF-α等介導(dǎo)的急性期蛋白和趨化因子激活可能會加劇病毒誘導(dǎo)的炎癥和病理學(xué)變化。Khong WX等[18]用抗IL-6抗體治療EV71感染的新生小鼠，與對照組相比顯著降低了死亡率和組織破壞程度，而且這些保護(hù)作用不依賴于病毒載荷。提示高水平IL-6可能與EV71感染過程中的發(fā)病率和死亡率存在因果關(guān)系，針對IL-6信號治療可能是治療重癥EV 71新的研究目標(biāo)。

發(fā)育研究表明，固有免疫反應(yīng)具有年齡依賴性的特點，有些特定模式在生命的早期被表達(dá)，而成人型模式在童年時才逐步建立[19]。比如嬰幼兒對感染信號的固有免疫應(yīng)答中，產(chǎn)生較高水平的某些促炎細(xì)胞因子，特別是IL-6、IL-1β、IL-23，并表現(xiàn)出偏向Th2和Th17型輔助T細(xì)胞的反應(yīng)，而抑制細(xì)胞內(nèi)病原體重要的Th1型細(xì)胞因子IFN-α和IL-12p70水平則較低[20，21]。因此，最近有學(xué)者提出，由于免疫應(yīng)答存在年齡依賴性，那么，控制病毒復(fù)制不力，或優(yōu)先產(chǎn)生病理性免疫應(yīng)答，或兩者共同作用，可以解釋EV71感染嬰幼兒嚴(yán)重病例和死亡率較年長兒高的現(xiàn)象[19]。

4 EV71感染對固有免疫的調(diào)節(jié)

在DC等APC在通過PRRs啟動抗感染免疫應(yīng)答的同時，病毒也通過進(jìn)化出的各種機(jī)制來抑制PRRs介導(dǎo)的信號通路，從而逃避宿主對病毒的免疫殺傷。EV71編碼的的非結(jié)構(gòu)蛋白3C、2A、2C都參與了此類調(diào)節(jié)。

4.1 EV71 3Cpro 幾乎參與了病毒復(fù)制過程的所有蛋白剪切，并針對宿主細(xì)胞固有免疫途徑的多個組件，導(dǎo)致I型IFN應(yīng)答的抑制。3Cpro通過分解RIG-Ⅰ-IPS-1復(fù)合物和破壞IRF3核轉(zhuǎn)位阻斷RIG-Ⅰ信令[7]；與TRIF結(jié)合，在半胱天冬酶抑制劑（Z-VAD-FMK）存在的條件下誘導(dǎo)其裂解，抑制其下游基因的表達(dá)[8]；直接切割信號分子TRAF3[22]、IRF7 [23]、IRF9[24]。3Cpro還裂解滅活多聚腺苷酸化系統(tǒng)裂解刺激因子（CSTF-64），抑制宿主前體mRNA 3'-末端加工和多聚腺苷酸化，可能會導(dǎo)致宿主細(xì)胞mRNA的成熟抑制[25]，有可能參與抵抗細(xì)胞抗病毒應(yīng)答，包括抑制病毒誘導(dǎo)的IFNβ產(chǎn)生。

4.2 EV71 2Apro 另一個蛋白酶，新近研究證實，它以RIG-Ⅰ樣受體MDA5為水解目標(biāo)[26]，并通過靶向切割在RIG-Ⅰ和MDA-5激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵接頭分子MAVS[27]，有效封鎖IFN-Ⅰ轉(zhuǎn)錄的上游，抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。Lu J等[12]還發(fā)現(xiàn)2PRO降低了干擾素受體1（IFNAR1）水平，阻止下游信號通路，從而抑制ISGs的活化。此外，2A pro可切割核孔蛋白62（Nup62），導(dǎo)致核孔復(fù)合物跨膜轉(zhuǎn)運功能的障礙，因而，可導(dǎo)致細(xì)胞因子、IFN等抗病毒蛋白的合成受到抑制，從而無法有效的清除病毒，這可能是EV71逃避先天性免疫引起重癥病例或死亡病例的重要機(jī)制之一[28]。

4.3 EV71 2C 可直接與IKKβ相互作用，抑制IKKβ的活化和IκBα（IKK）的磷酸化/降解，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的激活[29]。以此調(diào)節(jié)宿主的固有免疫反應(yīng)。

4.4其他 不久前劉穎等[30]用EV71（VR1432）感染Vero E6細(xì)胞后，進(jìn)行干擾素刺激，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）表達(dá)水平與胞質(zhì)內(nèi)相比明顯降低，表明EV71感染抑制Ⅰ型IFN信號通路中干擾素刺激基因因子3（IFN-stimulated gene factor 3，ISGF3，STAT1/STAT2/IRF9）的核轉(zhuǎn)位，從而影響干IFN效應(yīng)途徑中抗病毒蛋白的表達(dá)。

由此可以見，EV71利用其3Cpro、2Apro、2C等，從基因轉(zhuǎn)錄水平到蛋白翻譯水平多層次的抑制參與抗病毒固有免疫的效應(yīng)分子合成，從而使得病毒能夠突破固有免疫應(yīng)答的防線對宿主造成進(jìn)一步感染。針對這些環(huán)節(jié)的治療策略，有可能會改變疾病的預(yù)后。如蛋白酶抑制劑Rupintrivir對EV71 3Cpro有很好的抑制作用，體外用Rupintriviru與IFN-α組合處理EV71感染的細(xì)胞，對細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用比任何一個藥物單用顯著，顯示了強(qiáng)大的協(xié)同抗EV71活性[24]，為EV71感染治療展示了廣闊的前景。

綜上所述，EV71感染后固有免疫應(yīng)答在抗病毒感染中起到了不可替代的重要作用，EV71也進(jìn)化了機(jī)制逃避固有免疫的殺傷。但EV71與宿主固有免疫之間相互作用、以及固有免疫與適應(yīng)性免疫協(xié)同完成對EV71的免疫清除的機(jī)制，目前尚未完全明確。探索這些機(jī)制，有助于闡明EV71致病和組織損傷機(jī)理，為疫苗研發(fā)以及制定治療疾病的新策略提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sun LM，Zheng HY，Zheng HZ，et al.An enterovirus 71 epidemic in Guangdong Province of China，2008：epidemiological，clinical，and virogenic manifestations[J].Jpn J Infect Dis，2011，64（1）：13-18

[2]Akita S.Pathogen recognition by innate immunity and its signaling[J].Proe Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei，2009，85（4）：143-156

[3]Akira S，Uematsus，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell，2006，124（4）：783-801

[4]孫輝，蔣爭凡.抗病毒天然免疫研究[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2013，43（10）：815-823.

[5]Kuo RL，Kao LT，Lin SJ，et al.MDA5 Plays a Crucial Role in Enterovirus 71 RNA-Mediated IRF3 Activation[J].PLoS ONE，2013，8（5）：e63431.

[6]Gong X，Zhou JF，Zhu WF，et al.Excessive proinflammatory cytokine and chemokine responses of human monocyte-derived macrophages to enterovirus 71 infection[J].BMC Infect Dis，2012，12：224.

[7]Lei X，Liu X，Ma Y，et a1.The 3C protein of enterovirus 71 inhibits retinoid acid-inducible gcne I-mediated interferon regulatory factor 3 activation and type I interferon responses[J].J Virol，2010，84（16）：8051-8061.

[8]Lei X，Sun Z，Liu X，et a1.Cleavage of the adaptor protein TRIF by enterovirus 71 3C inhibits antiviral responses mediated by Toll一like receptor 3[J].J Virol，2011，85（17）：8811-8818.

[9]Kuo RL，Kao LT，Lin SJ，et al.MDA5 Plays a Crucial Role in Enterovirus 71 RNA-Mediated IRF3 Activation[J].PLoS ONE，2013，8（5）：e63431.

[10]Pang L，Gong X，Liu N，et al.A polymorphism in melanoma differentiation-associated gene 5 may be a risk factor for enterovirus 71 infection[J].Clin Microbiol Infect，2014，13.

[11]Liu ML，Lee YP，Wang YF，et al.Type I interferons protect mice against enterovirus 71 infection[J].J.Gen.Virol，2005，86：3263-3269.

[12]Lu J，Yi LN，Zhao J，et al.Enterovirus 71 Disrupts Interferon Signaling by Reducing the Level of Interferon Receptor 1[J]. J. Virol，2012，86（7）：3767-3776.

[13]Wang SM，Lei HY，Huang MC，et al.Modulation of cytokine production by intravenous immunoglobulin in patients with enterovirus 71-associated brainstem encephalitis[J].J Clin Virol，2006，37（1）：47-52.

[14]Wang SM，Lei HY，Su LY，et al.Cerebrospinal fluid cytokines in enterovirus 71 brain stem encephalitis and echovirus meningitis infections of varying severity[J].Clin Microbiol Infect，2007，13：677-682.

[15]Griffiths MJ，Ooi MH，Wong SC，et al.In enterovirus 71 encephalitis with cardio-respiratory compromise，elevated interleukin1beta，interleukin 1 receptor antagonist，and granulocyte colony-stimulating factor levels are markers of poor prognosis[J].J Infect Dis，2012，206：881-892.

[16]Wang SM，Lei HY，Liu CC.Cytokine immunopathogenesis of enterovirus 71 brain stem encephalitis[J]. Clin Dev Immunol，2012：876241.

[17]Wang SM，Lei HY，Huang KJ，et al.Pathogenesis of enterovirus 71 brainstem encephalitis in pediatric patients：roles of cytokines and cellular immune activation in patients with pulmonary edema[J].J Infect Dis，2003，188：564-570.

[18]Khong WX，F(xiàn)oo DG，Trasti SL，et al.Sustained high levels of interleukin-6 contribute to the pathogenesis of enterovirus 71 in a neonate mouse model[J].J Virol，2011，85：3067-3076.

[19]Gantt S，Yao L，Kollmann TR，et al.Implications of Age-Dependent Immune Responses to Enterovirus71 Infection for Disease Pathogenesis and Vaccine Design[J].J Ped Infect Dis，2013，2 （2）：162-170.

[20]Burl S，Townend J，Njie-Jobe J，et al. Age-dependent maturation of Toll-like receptor-mediated cytokine responses in Gambian infants[J].PLoS One，2011，6：e18185.

[21]Kollmann TR，Crabtree J，Rein-Weston A，et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults[J].J Immunol，2009，183：7150-7160.

[22]韓寧，肖霞，雷曉波，等.EV71 3C蛋白酶對腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）的切割作用研究[J].國際病毒學(xué)雜志，2014，21（1）：1-5.

[23]Lei X，Xiao X，Xue Q，et al.Cleavage of interferon regulatory factor 7 by enterovirus 71 3C suppresses cellular responses[J].J Virol，2013，87（3）：1690-1698.

[24]Hung HC，Wang HC，Shih SR，et al.Synergistic inhibition of enterovirus 71 replication by interferon and rupintrivir[J].J.Infect.Dis，2011，203：1784-1790.

[25]Weng KF，Li ML，Hung CH，et al.Enterovirus 71 3C Protease Cleaves a Novel Target CstF-64 and Inhibits Cellular Polyadenylation[J].PLoS Pathog，2009，5（9）：e1000593.

[26]Feng Q，Langereis MA，Lork M，et al.Enterovirus 2Apro targets MDA5 and MAVS in infected cells[J].J Virol，2014，88（6）：3369-3378.

[27]Wang B，Xi X，Lei X，et al.Enterovirus 71 Protease 2Apro Targets MAVS to Inhibit Anti-Viral Type I Interferon Responses[J].PLoS Pathog，2013，9（3）：e1003231.

[28]張亞洲，甘星，宋娟，等.EV71通過2A蛋白酶切割Nup66而抑制核轉(zhuǎn)運[J].病毒學(xué)報，2013，29（4）：421-425.

[29]Zheng ZH，Li HX，Zhang ZF，et al.Enterovirus 71 2C Protein Inhibits TNF-a-Mediated Activation of NF-kB by Suppressing IkB Kinase Β Phosphorylation[J]J Immunol， 2011，187（5）：2202-2212.

[30]劉穎，趙興卉，張曉鵬，等. EV71 抑制I 型干擾素信號通路中ISGF3 的核轉(zhuǎn)位[J].軍事醫(yī)學(xué)，2013，37 （10 ）：734-736.編輯/哈濤