腦膠質(zhì)瘤中EDNRB基因甲基化狀態(tài)的研究

摘要：目的 本研究采用巢氏PCR（nMSP法）和亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP法）方法，檢測手術(shù)切除腦膠質(zhì)瘤組織中候選抑癌基因EDNRB基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討EDNRB基因啟動子的異常甲基化水平在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及與臨床病病理資料之間的關(guān)系。方法 選取經(jīng)病理證實的20例腦膠質(zhì)瘤患者，術(shù)前均未行放療和化療，收集切除的腫瘤組織。同時收集2例腦挫裂傷患者正常腦組織進(jìn)行對照，應(yīng)用nPCR方法和BSP方法檢測標(biāo)本中EDNRB基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果 正常腦組織未見甲基化，低級別（I-II級）膠質(zhì)瘤中與高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率之間無明顯差別（X2=0.152.402， P=0.696）。結(jié)論 EDNRB基因的甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，EDNRB基因甲基化在腦膠質(zhì)瘤中較為普遍，與腫瘤進(jìn)展基本無關(guān)。EDNRB基因位于13q22，長約24kb，含7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼的非選擇性內(nèi)皮素受體B是一種G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體蛋白，在人體內(nèi)分布廣泛，在心血管系統(tǒng)、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。

關(guān)鍵詞：EDNRB基因；甲基化；腦膠質(zhì)瘤

EDNRB基因位于13q22，長約24kb，含7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼的非選擇性內(nèi)皮素受體B是一種G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體蛋白，在人體內(nèi)分布廣泛，在心血管系統(tǒng)、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。EDNRB基因所在的染色體位點13q22是腫瘤發(fā)生過程中一個經(jīng)常出現(xiàn)基因缺失的區(qū)域，目前推測該區(qū)域可能有某些腫瘤抑制基因存在，他們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。臺灣一項研究發(fā)現(xiàn)在白血病患者中EDNRB啟動子甲基化一個普遍現(xiàn)象[1]。法國一項研究顯示EDNRB啟動子甲基化可能在早期診斷前列腺癌中作為一種腫瘤標(biāo)志物[2]。目前尚未見到在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中研究EDNRB甲基化狀態(tài)的報道。

1臨床資料

取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院近2年膠質(zhì)瘤患者切除腫瘤標(biāo)本20例。記錄患者的臨床資料包括年齡、性別、腫瘤部位、WHO分類，所有患者均為首次手術(shù)，術(shù)前均未行放療和化療，采取標(biāo)本時選取無組織或出血部位。其中男性10例，女性10例。平均年齡45.2歲，腫瘤均為顯微鏡下全切。WHO腫瘤分級：Ⅰ-Ⅱ級8例，Ⅲ-Ⅳ級12例，2例正常腦組織取自腦挫裂傷患者失活腦組織。巢式PCR（nested PCR），是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。外引物F5'-GATTGAATTTTATTTTGGGGTTT-3'，R-TATATCAAACTCTACATTTTACCCC；內(nèi)引物F5'-AATTATTGATTGAATTTT

ATTTTGGG-3'，R5'-CTG GCC GAA AGA AAG AAA TGGT-3'。首輪PCR的反應(yīng)體系為25μl。10×PCR buffer2.5μl，dNTP0.5μl，模板4μl，引物（F、R）各1.5μl，MgCl22.5μl，Taq酶0.2μl，加雙蒸水至25μl；PCR反應(yīng)流程如下：95℃10分鐘預(yù)變性，PCR循環(huán)99℃ 6min，65℃120min，72℃33min。首輪PCR為30個循環(huán)，2μl首輪產(chǎn)物以1：4加雙蒸水稀釋，作為樣本加入次輪反應(yīng)，重復(fù)上述過程。

由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個靶位點的可能性增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。

2產(chǎn)物結(jié)果測序

根據(jù)BSP方法產(chǎn)物測序后結(jié)果，若原基因序列CpG島中的C即胞嘧啶發(fā)生了甲基化反應(yīng)，則測序后應(yīng)保持不變；若原基因序列中的胞嘧啶未發(fā)生甲基化反應(yīng)，則經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾、PCR擴(kuò)增和測序后應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）。根據(jù)測序結(jié)果可確定目的片段內(nèi)每個CpG島中胞嘧啶（C）的甲基化狀態(tài)，目前是檢測目的基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的金標(biāo)準(zhǔn)。全部測序工作由上海生物芯片公司完成。

用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行X2檢驗，推斷兩個或兩個以上總體率之間有無差別和兩變量間有無相關(guān)關(guān)系。采用精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05時，表示差異有顯著性。

3結(jié)果

所抽提的20例標(biāo)本中，經(jīng)檢測有16例DNA質(zhì)量合格，隨后對此16例標(biāo)本進(jìn)行甲基化修飾及測序檢測。

2例正常腦組織中未檢測出EDNRB基因甲基化。16例標(biāo)本中，檢測出6例標(biāo)本的EDNRB基因發(fā)生了啟動子的甲基化（37.5%，6/16），遠(yuǎn)高于正常組織的甲基化率（0%）；但因正常組織數(shù)量太少，故二者的差異未行統(tǒng)計學(xué)分析。低級別（I-II級）膠質(zhì)瘤中EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152，P=0.696）。患者年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤大小和腫瘤部位等因素與EDNRB基因甲基化無明顯相關(guān)。

我們對EDNRB基因啟動子甲基化情況與臨床病理資料的關(guān)系進(jìn)行了分析，低級別（I-II級）膠質(zhì)瘤中EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152.402，P=0.696），本研究沒有發(fā)現(xiàn)EDNRB基因甲基化與患者的年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤大小等因素相關(guān)。

4討論

EDNRB基因編碼的非選擇性內(nèi)皮素受體B是一種G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體蛋白，在人體內(nèi)分布廣泛，在心血管系統(tǒng)、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。EDNRB基因所在的染色體位點13q22是腫瘤發(fā)生過程中一個經(jīng)常出現(xiàn)基因缺失的區(qū)域，本實驗我們對EDNRB基因啟動子甲基化情況與臨床病理資料的關(guān)系進(jìn)行了分析。實驗發(fā)現(xiàn)，EDNRB基因甲基化在腦膠質(zhì)瘤中的發(fā)生率為37.5%，而正常腦組織中未檢測出甲基化現(xiàn)象；說明EDNRB基因的甲基化在腦膠質(zhì)瘤中是一種較為普遍存在的現(xiàn)象，可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在級別為I-II級的膠質(zhì)瘤中，EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152.402，P=0.696）；說明EDNRB基因的甲基化可能與腫瘤的進(jìn)展無關(guān)。我們此研究發(fā)現(xiàn)，與其他腫瘤的研究報道基本一致：即抑癌基因的甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，而與腫瘤進(jìn)展基本無關(guān)。

腫瘤發(fā)生時常出現(xiàn)不同程度的DNA甲基化模式改變，通過對啟動子區(qū)高甲基化CpG島的檢測從而發(fā)現(xiàn)因DNA甲基化沉默的抑瘤基因，已成為一種尋找腫瘤相關(guān)基因的新方法。某些基因高甲基化具有腫瘤細(xì)胞特異性，可作為基因標(biāo)志應(yīng)用于腫瘤的診斷及臨床預(yù)后估價[3]。Toshihiko[4]等研究了20例星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤和20例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)血漿標(biāo)本中P16基因啟動子的甲基化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%（12/20）的星形細(xì)胞瘤標(biāo)本和相應(yīng)的75%血漿標(biāo)本中可以檢測到P16基因甲基化，而在少突膠質(zhì)瘤中只有l(wèi)例發(fā)生甲基化，并且腦干星形膠質(zhì)瘤中均可在血漿中檢測到P16基因甲基化。Weaver等[5]研究膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織和血漿中的腫瘤特異性DNA甲基化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%患者的膠質(zhì)瘤中含有啟動子的甲基化，60%以上患者血漿中也可以檢測到相關(guān)基因的啟動子甲基化。因此，某些基因啟動子的甲基化水平能夠作為診斷膠質(zhì)瘤的生物學(xué)指標(biāo)。但哪些基因具有較高的特異性，哪些可以通過非侵入性方法進(jìn)行檢測以及更加簡單快速檢測基因甲基化的實驗方法還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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[5]Weaver KD，Grossman SA，Heman JG.Methylated tumor specific DNA as a plasma biomarker in patients with glioma[J].Cancer Investigation，2006，24（1）：35-40.

編輯/孫杰