乙肝寧顆?？挂倚透窝撞《镜捏w外實驗研究

摘要：目的 探討體外乙肝寧顆?？挂腋尾《净钚?。方法 將不同濃度乙肝寧顆粒與HepG⒉⒉15細(xì)胞株共培養(yǎng)9d，以拉米夫定為陽性對照藥，以MTT比色法觀察藥物細(xì)胞毒性；用ELIS法測定細(xì)胞上清液中乙型肝炎病毒e抗原（ HBeAg），乙型肝炎病毒s抗原（ HBsAg）；采用熒光定量PCR法（FQ-PCR） 測定細(xì)胞上清液HBV DNA，計算抑制率。結(jié)果 乙肝寧顆粒在體外能有效抑制HepG⒉⒉15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，最大抑制率分別為54.69%和25.93%；對HBV DNA的復(fù)制有一定抑制作用（P<0.05）。結(jié)論 乙肝寧顆粒能有效抑制HepG⒉⒉15細(xì)胞中HBV復(fù)制，說明在體外具有顯著的抗乙型肝炎病毒作用，且毒性較小，具有良好應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：乙肝寧顆粒；HepG⒉⒉15細(xì)胞；乙型肝炎病毒

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病，也是我國當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。中醫(yī)藥是我國的特色和寶庫，在治療病毒性肝炎方面發(fā)現(xiàn)了不少有效的單方和復(fù)方制劑。

乙肝寧顆粒是基于理論研究和臨床觀察，將黃芪、黨參、白花蛇舌草、綿茵陳等13味中藥按君、臣、佐、使進(jìn)行配伍而制成的復(fù)方顆粒劑。具有補(bǔ)氣健脾，活血化瘀，清熱解毒的功效，用于慢性乙型肝炎[1]。文獻(xiàn)報道[2-8]臨床上應(yīng)用乙肝寧顆粒治療慢性乙肝療效較好。伍一文[9]等對其保肝、降酶、抗鴨乙肝病毒及免疫功能等作用進(jìn)行了實驗研究。為探討乙肝寧顆?？挂腋尾《咀饔?，本文用HepG⒉⒉15細(xì)胞株為模型，考察了用藥后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、E抗原（HBeAg）的改變，并采用熒光定量PCR法考察其對HBV DNA的抑制效果，評價其抗HBV活性。

1 材料

⒈1試藥 HepG⒉⒉15細(xì)胞株 （購自上海細(xì)胞所），乙肝寧顆粒（九芝堂股份有限公司，購于東方大藥房，批號130124），拉米夫定（3TC，葛蘭素史克制藥有限公司，批號13020027），HBeAg診斷試劑盒（批號201304035）和HBsAg診斷試劑盒（批號201307009）（上海華泰生物工程公司）、HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒 （批號20130617）（上?？迫A生物工程股份有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（Sigma USA），MEM培養(yǎng)基粉、丙酮酸鈉、胎牛血清（上海韻涵生物科技有限公司）、G418（Gibco，USA），Tryple express（Invitrogen，USA），

⒈2儀器 熒光定量PCR儀（ABl7500，ABI，USA），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，USA），-80℃冰箱，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡（德國Leica公司），生物安全柜（上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司）。

2 方法

⒉1細(xì)胞模型[10] HepG⒉⒉15細(xì)胞株（購自上海細(xì)胞所），細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，500 mg·L-1G418），置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔3d換液，6d傳代1次。待HBV DNA表達(dá)穩(wěn)定后開始實驗。

2.2乙肝寧顆粒溶液與3TC溶液的配制 將乙肝寧顆粒研細(xì)，準(zhǔn)確稱取乙肝寧顆粒粉末，3TC適量，溶解于無菌雙蒸水中，按每次用量分裝成若干份，保存于-20℃冰箱中，用時取出一份，用含2%胎牛血清，500mg·L-1 G418的培養(yǎng)基稀釋制備成質(zhì)量濃度分別為25mg·L-1，50mg·L-1，100mg·L-1，200mg·L-1，400mg·L-1的乙肝寧顆粒溶液，以及質(zhì)量濃度分別為100mg·L-1，10mg·L-1，1mg·L-1，0.1 mg·L-1，0.01mg·L-13TC的溶液。

⒉3藥物細(xì)胞毒性實驗 參照Mosmann建立的四甲基偶氮唑鹽法（MTT）[11]，檢測藥物對HepG⒉⒉15細(xì)胞生長的抑制作用。具體方法為HepG2.2.15細(xì)胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至3.0×106cells·mL-1。加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜待貼壁。吸去上清后分別加入乙肝寧顆粒供試品溶液和3TC溶液的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，pH 7.2），每孔100皿，每個濃度3復(fù)孔。同時設(shè)不加藥物的細(xì)胞對照組。同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天收取上清液（-80℃冰箱保存）并更換原濃度新鮮藥液，共加藥培養(yǎng)9d。9d后，采用MTT法，測定570nm的吸光度（A），觀察藥物對細(xì)胞的毒性。實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞存活率，按Reed-Meuench法[12]計算半數(shù)有毒濃度Tc50和最大無毒濃度TC0。TC50即細(xì)胞存活率為50%時的藥物濃度；一般認(rèn)為在藥物作用下若細(xì)胞存活率>95%，此藥物濃度即為TC0，對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，為藥物作用的安全無毒性[13]。公式如下：細(xì)胞存活率%A570（樣品）/A570（對照）×100%

TC50Anti log[logB+（50-B）的抑制百分率/（A-B）的抑制百分率×C]×100%

其中A570（樣品）為加入乙肝寧顆粒供試品或3TC后的細(xì)胞吸光度，A570 （對照）為空白對照的細(xì)胞吸光度，A≥抑制50%藥物濃度，B≤抑制50%藥物濃度，C=log稀釋倍數(shù)。

⒉4藥物抗HBV實驗 HepG⒉⒉15細(xì)胞用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至3.0×104cells·mL-1加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1mL，37℃、飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)過夜，于48h后換入不同濃度的乙肝寧顆粒和3TC的DMEM混合培養(yǎng)液培養(yǎng)9d，9d后將細(xì)胞消化凍存于液氮罐中。實驗同時設(shè)3孔無藥物細(xì)胞對照，并重復(fù)3次。第9d收集各孔上清液至1.5 mL離心管中-20℃凍存，待檢測HBsAg、HBeAg的水平和HBV DNA的含量。

⒉5HBsAg，HBeAg的檢測 采用ELISA法檢測上清液中HBsAg，HBeAg，實驗操作按試劑盒說明書執(zhí)行。每個樣品平行3次，實驗重復(fù)3次。結(jié)果按下列公式計算抑制率。抑制率%=（A對照組-A用藥組）/A對照組×100%

⒉6 HBV DNA的檢測 采用FQ-PCR法檢測上清液中細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的含量，實驗操作按試劑盒說明書進(jìn)行。每個樣品平行3次，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果按下式計算抑制率：抑制率=（對照組HBV DNA量-用藥組HBV DNA量）/對照組HBV DNA量×100%

⒉7藥物效果評價 藥物抗HBV活性用選擇指數(shù)（Selectivity Index，SI）進(jìn)行評價[14]。SI=TC50/IC50。IC50（半數(shù)有效濃度）表示抑制率為50%時的藥物濃度。當(dāng)SI>2時，表明藥物有效低毒；當(dāng)1≤SI≤2時，提示藥物低效低毒；當(dāng)SI<1時，則表明藥物為毒性作用。SI值越大，表示藥物對HBV的抑制作用越強(qiáng)，細(xì)胞毒性越小。

⒉8統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以（x±s）表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

⒊1乙肝寧顆粒和3TC對HepG⒉⒉15細(xì)胞毒性作用 不同濃度的乙肝寧顆粒和3TC對HepG⒉⒉15細(xì)胞的毒性作用見表1。

從表1中可以看出，乙肝寧顆粒在200mg·L-1濃度下，細(xì)胞存活率>95%，即TC0=200mg·L-1，可認(rèn)為乙肝寧顆粒在此濃度下對HepG⒉⒉15細(xì)胞基本無毒性，而3TC只有在0.01mg·L-1濃度下細(xì)胞存活率>95%。同時可以知道，乙肝寧顆粒在400mg·L-1 濃度下，3TC在100mg·L-1濃度下對細(xì)胞活力的抑制作用均小于10%，說明在此濃度下，乙肝寧顆粒和3TC均無明顯細(xì)胞毒性，可用于觀察藥物對細(xì)胞中HBV復(fù)制的抑制作用。

⒊2乙肝寧顆粒和3TC對Hep G⒉⒉15細(xì)胞分泌HBsAg，HBeAg的影響 根據(jù)藥物細(xì)胞毒性實驗確定了藥物濃度范圍。選擇1，3，5，7，9 d加藥后收集的細(xì)胞上清液作為樣品，用ELISA法檢測其中HBsAg，HBeAg分泌情況（見表2～5）。

由結(jié)果可知，不同濃度的乙肝寧顆粒溶液與3TC溶液對HepG⒉⒉5細(xì)胞分泌HBeAg，HBsAg均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，其抑制率也逐漸增加。在同一濃度下，乙肝寧顆粒對HBeAg的抑制作用均強(qiáng)于HBsAg，作用9d后，質(zhì)量濃度為400mg·L-1乙肝寧顆粒溶液對HBeAg，HBsAg的抑制率分別為25.93%和45.44%，而質(zhì)量濃度為100 mg·L-13TC溶液對HBeAg，HBsAg的抑制率分別為25.93%和19.86%，說明乙肝寧顆粒對HepG⒉⒉5細(xì)胞分泌HBeAg，HBsAg的抑制作用強(qiáng)于3TC。

⒊3乙肝寧顆粒和3TC對HBV DNA的抑制效果 選擇最后一次得到的上清液和藥物處理的細(xì)胞作為樣品，通過實時定量PCR檢測細(xì)胞上清液中病毒載量， 考察乙肝寧顆粒和3TC對HBV DNA的抑制效果（見表6）。

由結(jié)果可知，乙肝寧顆粒對HepG⒉⒉5細(xì)胞分泌的HBV DNA有較為顯著的抑制作用，隨著藥物濃度增加，其抑制作用亦增強(qiáng)，除藥物濃度為25mg·L-1的乙肝寧顆粒組外，其余組別與細(xì)胞對照組比較P<0.05，差異有顯著性。乙肝寧顆粒對HBV DNA抑制效果弱于3TC，但兩者相比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4藥物效果評價結(jié)果 乙肝寧顆粒對HBeAg 的SI為>20，對HBsAg 的SI為>24，表明乙肝寧顆粒能夠顯著抑制對HepG⒉⒉5細(xì)胞分泌HBeAg，HbsAg，具有較強(qiáng)的體外抑制HepG⒉⒉5細(xì)胞表達(dá)HBV抗原的作用，提示乙肝寧顆粒在體外實驗中有抑制HBV的作用。

4 討論

乙型肝炎是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。中國每年約有35萬人死于慢性乙肝相關(guān)的疾病[15-16]。目前治療乙型肝炎主要采用抗病毒治療，其藥物主要包括干擾素和核苷類似物兩類，亦取得了一定療效。但由于其毒副作用導(dǎo)致應(yīng)用受到較大的限制，因此積極開發(fā)安全有效，毒副作用小，療程短，費(fèi)用低的抗HBV藥是目前亟待解決的問題，而中醫(yī)藥是我國的特色和優(yōu)勢，對治療慢性乙型肝炎積累了一定的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)了不少有效的單方或者是復(fù)方，為篩選理想的抗HBV藥物提供了思路和希望。

本實驗采用HepG⒉⒉15細(xì)胞株體外培養(yǎng)方法，觀察受試藥物對乙型肝炎病毒的HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用以及對病毒核酸的抑制作用。HepG⒉⒉15細(xì)胞是帶有G418抗性基因片段與含HBV DN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系（ HepG2）的2.2.15細(xì)胞系，能在體外長期培養(yǎng)，穩(wěn)定、高水平地分泌HBV顆粒（ Dane顆粒）、HBsAg，HBeAg以及 HBVDNA，并能產(chǎn)生大量復(fù)制中間體，再現(xiàn) HBV 在肝細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)[17]。用該細(xì)胞系進(jìn)行抗HBV藥物篩選，結(jié)果可以比較準(zhǔn)確地預(yù)測藥物在人體內(nèi)的作用，是目前國內(nèi)外公認(rèn)和常用的體外評價HBV藥物的細(xì)胞模型，現(xiàn)已成為申報抗新藥必須做的體外實驗?zāi)Ｐ蚚18-21]。

實驗中以拉米夫定（3TC）為陽性實驗對照藥物，是目前治療病毒性肝炎的常用藥物[22-23]。其主要作用機(jī)制是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后磷酸化成拉米夫定三磷酸鹽（L-TP），與脫氧胞苷三磷酸（dCTP）競爭結(jié)合位點(diǎn)，抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，阻斷合成新HBV DNA的鏈化，達(dá)到抑制HBV復(fù)制的目的[24]。但存在治療乙肝時用時長，易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用大，停藥后易反彈等問題。實驗結(jié)果表明，3TC抗HBV病毒的效果雖然優(yōu)于乙肝寧顆粒，但其細(xì)胞毒性亦比乙肝寧顆粒強(qiáng)得多。乙肝寧顆粒由黃芪、白花蛇舌草、茵陳、首烏、丹參、茯苓、白芍、黨參等組成。黃芪補(bǔ)氣升陽、利水消腫；白花蛇舌草清熱解毒，利濕；茵陳清熱利濕、退黃；金錢草清利濕熱，利水通淋，除濕退黃；首烏養(yǎng)血滋陰、解毒通便；黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津；白芍平肝柔肝、緩急止痛；茯苓利水滲濕、健脾和胃；丹參活血祛瘀、清心除煩。此方共成調(diào)氣健脾、滋養(yǎng)肝腎、利膽清熱、活血化瘀之法則，在抑制病毒復(fù)制的同時提高機(jī)體免疫力，降低藥物對機(jī)體的損傷，并可促進(jìn)正常肝細(xì)胞的恢復(fù)與再生。

采用HepG⒉⒉15細(xì)胞株體外培養(yǎng)方法，實驗條件易于控制、研究結(jié)果均衡性較好。但離體體外實驗不能完全反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)和藥物在體內(nèi)的代謝情況。因此，此實驗研究雖顯示乙肝寧顆粒具有較好的對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用以及對病毒核酸的抑制作用。

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編輯/王敏