斑馬魚(yú)在人類疾病及藥物篩選模型構(gòu)建中的應(yīng)用

人類疾病及臨床藥物篩選大多采用鼠類動(dòng)物來(lái)建模。目前，低等脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物已獲得極大的關(guān)注。斑馬魚(yú)具有多方面的優(yōu)勢(shì)：包括在基因和器官系統(tǒng)上與人類具有很高的同源性，強(qiáng)繁殖力，體外受精，基因易于操作以及整個(gè)成年早期身體透明等。本文就近10年來(lái)人類疾病及藥物篩選中有關(guān)斑馬魚(yú)研究的四個(gè)領(lǐng)域展開(kāi)討論。這些領(lǐng)域分別是：①傷口愈合/修復(fù)；②胃腸道疾??；③微生物-宿主相互作用；④遺傳性疾病和藥物篩選。

1 創(chuàng)傷愈合/修復(fù)

創(chuàng)傷愈合是各種損傷組織和器官的一種重要的生物反應(yīng)。一系列引起上皮損傷和機(jī)體屏障破壞的因素激發(fā)了一種被稱為 \"修復(fù)\" 的生物反應(yīng)，它起著封鎖損傷區(qū)域，防止其擴(kuò)散以及重建機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。這種 \"創(chuàng)傷愈合\" 反應(yīng)既包括一些上皮細(xì)胞遷移到損傷區(qū)域，同時(shí)也有上皮細(xì)胞增殖來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞池等兩部分。認(rèn)識(shí)到這種反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制或許就會(huì)給那些正遭受著像缺氧癥、燒傷以及癌癥等慢性炎性疾病的患者產(chǎn)生深厚的影響。斑馬魚(yú)身體透明，具有很強(qiáng)的成像特點(diǎn)使研究人員在基因操作時(shí)更加容易，從而使得這種動(dòng)物成為研究針對(duì)各種損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)的理想模型[1]。此外，斑馬魚(yú)所具有較強(qiáng)的肢體和心臟組織再生能力也使得它們成為一種探索再生分子機(jī)制的強(qiáng)大動(dòng)物模型。最有名的斑馬魚(yú)損傷模型是仔魚(yú)尾巴創(chuàng)傷模型，在此模型中仔魚(yú)尾鰭的一段被切除了。研究人員利用這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的損傷模型在中性粒細(xì)胞特有的過(guò)氧化物酶催化劑轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)的綠色熒光蛋白（EGFP）研究了最新的中性粒細(xì)胞趨化到損傷部位的機(jī)制[2]。一些研究人員還把編碼過(guò)氧化氫酶的mRNA注射到斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程的一個(gè)細(xì)胞階段去推定活性氧化物H2O2在創(chuàng)傷愈合應(yīng)答中的作用[3]。在斑馬魚(yú)體內(nèi)，角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生H2O2來(lái)減少軀體感覺(jué)軸突的再生。與尾鰭模型相似，神經(jīng)元的再生也同樣需要過(guò)氧化氫酶基因的激活[4]。此外，即使在角質(zhì)化細(xì)胞完好時(shí)，隨著神經(jīng)元的損傷H2O2的變化也能促進(jìn)軸突再生[5]。這些成果可以擴(kuò)展到對(duì)人類外傷性神經(jīng)損傷以及其后的四肢功能喪失機(jī)制的認(rèn)識(shí)。除了皮膚損傷研究外，斑馬魚(yú)還被用于心臟組織再生能力的研究。斑馬魚(yú)心臟組織損傷后的反應(yīng)不同于哺乳動(dòng)物，后者心臟組織損傷后不可以再生而是形成了疤痕，而斑馬魚(yú)在心室被切除了20%后，心臟組織2個(gè)月內(nèi)就可以完全再生[6]。斑馬魚(yú)的這種避免疤痕形成的能力需要Mps1（一種有絲分裂關(guān)鍵酶）的激活[7]。此外，心臟再生包含了一系列損傷修復(fù)基因的上調(diào)，同時(shí)也可能有血小板衍生生長(zhǎng)因子B信號(hào)的激活[8]。以斑馬魚(yú)為模型的心臟再生研究或許可以獨(dú)辟蹊徑，找到對(duì)缺血性心臟病患者產(chǎn)生深厚影響的獨(dú)特方法。

2 胃腸道疾病

斑馬魚(yú)的消化系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物極為相似，同樣包含了一個(gè)肝臟、胰腺、膽囊以及一個(gè)具有吸收和分泌功能的線性分段的腸道[9-10]。腸上皮在腸道的全程中都發(fā)揮著作用且它還包含了許多同樣也能在哺乳動(dòng)物身上找到的上皮細(xì)胞，包括：吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞等[11-12]。有趣的是，一項(xiàng)還在進(jìn)行中的基因誘變篩查研究產(chǎn)生了一些發(fā)生突變的斑馬魚(yú)，它們發(fā)生自發(fā)性的腸、胰、及肝上皮突變[13]。后來(lái)還發(fā)現(xiàn)這些突變了的斑馬魚(yú)在用了復(fù)方阿司匹林處理后，可以導(dǎo)致核β-連環(huán)蛋白的堆積以及增加了像cmyc 和axin2這樣的下游基因的表達(dá)[14]。而復(fù)方阿司匹林誘導(dǎo)人類[15-16]和大鼠[17]發(fā)生突變后腸息肉會(huì)大量增生，所以這種復(fù)方阿司匹林斑馬魚(yú)模型或許可以用在基因、藥物篩選以及毒理學(xué)研究上。肝腫瘤基因譜分析顯示，人類和斑馬魚(yú)之間有132個(gè)基因是明顯重疊的[18]。這些基因包括那些涵蓋β-環(huán)連蛋白、RSA蛋白激酶信號(hào)通路、以及控制細(xì)胞粘附和凋亡、在人類和斑馬魚(yú)身上都具有的肝特定代謝等過(guò)程的基因[19]。肝毒素硫代乙酰胺可引起斑馬魚(yú)肝細(xì)胞發(fā)生癌變。斑馬魚(yú)暴露在硫代乙酰胺的環(huán)境下12w左右，就可導(dǎo)致與肝細(xì)胞癌相關(guān)的病理改變[20]。人類肝細(xì)胞癌發(fā)病率日益增長(zhǎng)與HCV感染日益增長(zhǎng)密切相關(guān)，尤其是感染了具有致癌作用的HCV核心蛋白[21]，這也使得斑馬魚(yú)這個(gè)模型與人類的疾病密切相關(guān)。胰腺癌成為極常見(jiàn)的第四大腫瘤。這可能歸結(jié)于有限的診斷工具以及有限的檢查這種疾病的能力。胰腺外分泌細(xì)胞是95%以上胰腺癌的罪魁禍?zhǔn)住Ｖ两褚鹑祟愅夥置谛砸认侔┰鲩L(zhǎng)的胰腺細(xì)胞群還是個(gè)未解之迷，但研究人員已開(kāi)始用斑馬魚(yú)模型來(lái)探究這個(gè)重要的迷。研究人員利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型發(fā)現(xiàn)當(dāng)正常的胰腺祖細(xì)胞分裂時(shí)，熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因模型魚(yú)卻阻止了細(xì)胞分裂，反而產(chǎn)生了許多未分裂的祖細(xì)胞。而這些祖細(xì)胞在經(jīng)過(guò)3～9個(gè)月左右就轉(zhuǎn)化成了創(chuàng)胰腺癌。這些癌細(xì)胞同時(shí)也表達(dá)了大量的頑固性基因以及一些下游頑固性目標(biāo)基因，這種胰腺癌細(xì)胞畸變信號(hào)傳導(dǎo)方式也是人類胰腺癌的典型代表[21]。這個(gè)首次建立的致癌外分泌腺胰腺祖細(xì)胞斑馬魚(yú)模型或許會(huì)成為胰腺癌的細(xì)胞起源。除癌癥模型之外，近幾年來(lái)消化系統(tǒng)疾病中一個(gè)引起顯著關(guān)注的領(lǐng)域是炎癥性腸?。↖BD）中斑馬魚(yú)造模的發(fā)展。在人類，IBD是易感宿主與他們的共生微生物之間相互作用失調(diào)的結(jié)果[22-23]。藥理治療中應(yīng)用抗炎藥、免疫抑制劑、以及疾病的外科手術(shù)治療也起到一定的作用[24]。一些研究人員試著把這種結(jié)腸炎的半抗原惡唑酮模型用成年斑馬魚(yú)改進(jìn)。Brugman等人的研究表明，用惡唑酮處理5h左右的斑馬魚(yú)模型腸上皮損傷和杯狀細(xì)胞消耗可持續(xù)高達(dá)7d[25]。2， 4， 6-三硝基苯磺酸（TNBS）可以用來(lái)研究急慢性腸炎。把具有3個(gè)受精期（dfp）的仔魚(yú)暴露于TNBS環(huán)境中3～5d可以構(gòu)建結(jié)腸炎斑馬魚(yú)仔魚(yú)模型[26]。研究人員發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)了整個(gè)斑馬魚(yú)體內(nèi)，腸內(nèi)高表達(dá)il1b，腸內(nèi)脂質(zhì)代謝反應(yīng)發(fā)生了改變，杯狀細(xì)胞增生以及腸道收縮等現(xiàn)象[27]。最近，有研究利用非甾體類抗炎藥格拉菲寧建立了斑馬魚(yú)上皮細(xì)胞損傷模型[28]。

3 微生物-宿主相互作用

應(yīng)用斑馬魚(yú)去探究微生物-宿主相互作用的細(xì)胞和分子機(jī)制受到廣泛的關(guān)注。研究包括人類的許多種疾病中，如炎癥性腸病IBD，肥胖和糖尿病，腸性疾病的治愈，過(guò)敏性腸綜合癥等。斑馬魚(yú)可以成為革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌、分支桿菌和多種病毒的宿主[29]。斑馬魚(yú)是一個(gè)研究細(xì)菌-宿主相互作用過(guò)程的理想模型。一系列比較恒定的探測(cè)檢驗(yàn)點(diǎn)常?？梢詸z測(cè)到細(xì)菌及它們相關(guān)的物質(zhì)（像DNA，RNA等）和一些膜結(jié)構(gòu)物（像肽聚糖，LPS-脂蛋白等）。研究最多的細(xì)菌相關(guān)物質(zhì)是目前仍有爭(zhēng)議的革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的LPS。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，TLR4可以檢測(cè)到LPS，這與其共同受體MD2及CD-14密切相關(guān)[30]。與人類相似，高劑量的LPS對(duì)斑馬魚(yú)也是有毒害作用的[31]。許多研究應(yīng)用共生的無(wú)菌斑馬魚(yú)證實(shí)了腸道堿性磷酸酶隨著微生物的定居而有所下降[32]。另一個(gè)重要的TLR系統(tǒng)是TLR5，它具有監(jiān)測(cè)出鞭毛蛋白和激活多種包含NF-κB的信號(hào)通路[33]。與哺乳動(dòng)物相似，在斑馬魚(yú)體內(nèi)監(jiān)測(cè)出鞭毛蛋白（實(shí)驗(yàn)中是沙門(mén)菌屬的衍生物）可以誘導(dǎo)出多種基質(zhì)金屬蛋白酶基因的表達(dá)以及一些像il1b， il8 ，ifn和cxcl-C1c這樣的炎癥標(biāo)記物[34]。 除了TLRs之外，細(xì)胞間的感受器Nod1和Nod2是哺乳動(dòng)物重要的體內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)。在斑馬魚(yú)胚胎感染模型中，Nod1或Nod2的損耗都會(huì)導(dǎo)致對(duì)沙門(mén)菌屬易感性的增加[35]。斑馬魚(yú)模型這種能在一種針對(duì)各種細(xì)菌刺激的細(xì)胞類型的特殊形式使得它成為一個(gè)強(qiáng)大的解釋復(fù)雜的宿主-微生物相互作用機(jī)制的系統(tǒng)。

4 遺傳性疾病和藥物篩選

斑馬魚(yú)具有強(qiáng)大繁殖力、身體透明體的特點(diǎn)，尤其適合遺傳篩選性的研究。可從正反向兩個(gè)途徑研究建立新的斑馬魚(yú)表現(xiàn)型模型來(lái)識(shí)別出與許多與人類疾病表現(xiàn)型相關(guān)的新基因。也可用一種省時(shí)省力的方式篩選斑馬魚(yú)疾病模型發(fā)現(xiàn)一些疾病抑制藥物。至今，已有兩個(gè)重要的途徑在斑馬魚(yú)模型中進(jìn)行正向基因篩選。第一途徑是：用乙基亞硝基脲誘變劑（EUN）處理雄性斑馬魚(yú)，接著篩選出具有像腎囊腫或心力衰竭這樣表現(xiàn)型的斑馬魚(yú)模型[36]。另一個(gè)突變途徑是應(yīng)用隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄病毒插入[37]。擴(kuò)張性心肌?。―CM）是心力衰竭病例中至少一半的病因。DCM常源自于因心肌梗塞或感染而引起的早期心臟損傷[38]。斑馬魚(yú)篩選模型發(fā)現(xiàn)大量的模型魚(yú)具有心臟病變。有關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)這些突變體中的兩個(gè)sih 和 pickwickm171是通過(guò)心肌壁變薄及不完全的收縮引起心臟擴(kuò)張的[39-40]。因這兩個(gè)基因都是熟知的在人類DCM至關(guān)重要的作用，所以這些突變體斑馬魚(yú)模型是研究這種病理過(guò)程模型的補(bǔ)充。近來(lái)，利用反向基因途徑已建立了哈欽森-吉爾夫德早衰癥綜合征 （HGPS） 的斑馬魚(yú)模型，此病是一種罕見(jiàn)的早衰綜合征。在斑馬魚(yú)模型中，研究人員利用可控的功能丟失突變和嗎啉代層蛋白及progerin組合物產(chǎn)生了能夠活到成年的斑馬魚(yú)模型。這些模型涵蓋了早期衰老的表型和分子信號(hào)，包括：脂肪代謝障礙、異常的肌肉組織以及顱面骨骼結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡的增加和細(xì)胞周期的阻止[41]。這些表型與HGPS患者的臨床表型極為一致，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了用反向基因途徑去建立人類疾病的斑馬魚(yú)模型觀念的可靠性。

自醫(yī)學(xué)研究之初，動(dòng)物模型就一直被利用著。大多數(shù)人類疾病模型中，小鼠模型毋庸置疑是人類疾病模型中最受偏愛(ài)的且應(yīng)用最廣的動(dòng)物模型。盡管應(yīng)用小鼠模型獲得了大量的知識(shí)，但是長(zhǎng)的妊娠期和性成熟期以及高成本的飼養(yǎng)和繁殖費(fèi)用都給這個(gè)模型的應(yīng)用帶來(lái)了很多重大的限制性。而且，小鼠實(shí)驗(yàn)多需要更多的勞動(dòng)力且也不是很適合進(jìn)行高通量藥物篩選。這些限制性都促使發(fā)展另外一種在花費(fèi)高的模型上研究開(kāi)始之前就可用于提供內(nèi)部基因或藥物靶點(diǎn)信息研究的模型。透明的、斑馬魚(yú)仔魚(yú)模型就有填補(bǔ)這個(gè)重要位置（即研究人類疾病，促使快速、生理有關(guān)的體內(nèi)篩選）的潛能。隨著斑馬魚(yú)和人類之間更多相關(guān)基因、解剖以及生理特點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，這種脊椎動(dòng)物模型的相關(guān)性及應(yīng)用就可成為小鼠模型系統(tǒng)的強(qiáng)有力的補(bǔ)充。

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